Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) ass eng Genombearbeitungstechnik vun der drëtter Generatioun, déi d'Welt mat hiren héijen Duerchsatzresultater revolutionéiert huet. Si gouf benotzt fir verschidde biologesch Krankheeten an Infektiounen ze behandelen. Verschidde Bakterien an aner Prokaryoten (wéi Archaea) hunn och CRISPR/Cas9-Systemer fir sech géint Phagen ze verdeedegen. Et gouf bericht, datt CRISPR/Cas9-baséiert Strategien de Wuesstum an d'Progressioun vun dräifach negativen Broschtkriibs (TNBC) hemme kënnen, andeems se potenziell verännert Resistenzgenen, Transkriptioun an epigenetesch Reguléierung gezielt hunn. Dës therapeutesch Interventiounen kënnen hëllefen, usprochsvoll Problemer wéi Medikamentresistenz ze léisen, déi souguer bei TNBC observéiert gëtt. Aktuell gi verschidde Methode benotzt fir CRISPR/Cas9 un Zilzellen ze liwweren, wéi z. B. physikalesch (Mikroinjektioun, Elektroporatioun an hydrodynamesch Modi), viral (Adeno-assoziéiert Virus a Lentivirus) an net-viral (Liposomen a Lipid-Nanopartikelen). Obwuel verschidde Modeller entwéckelt goufen, fir déi molekular Ursaache vun TNBC ze studéieren, limitéiert de Manktem u sensiblen a gezielte Methoden fir d'Genombearbeitungsinstrumenter in vivo ze liwweren, hir klinesch Uwendung. Zesummegefaasst ënnersicht dës Iwwerpréiwung grëndlech de Fortschrëtt, d'Erausfuerderungen, d'Limitatiounen an d'Perspektiven vun der CRISPR/Cas9-Behandlung fir TNBC baséiert op existente Beweiser. Mir beliichten och, wéi d'Kombinatioun vun kënschtlecher Intelligenz a maschinellem Léieren d'CRISPR/Cas9-Strategien an der Behandlung vun TNBC verbessere kann.
Kriibs ass charakteriséiert duerch onkontrolléiert Zelldeelung, Stéierungen vun Zellzyklus-Checkpoints a Mutatiounen an Tumorsuppressorgenen (TSGs) (Matthews et al., 2022). Ënnert de verschiddene Kriibsarten ass Broschtkriibs déi heefegst Kriibsart bei Fraen an huet weltwäit eng héich Mortalitéitsquote (Waks a Winer, 2019). Broschtkriibs ass eng heterogen Krankheet mat verschiddene Charakteristiken, wéi histologesch a biologesch Charakteristiken, klinesch Presentatioun a Verhalen, a Reaktioun op d'Behandlung (Weigelt et al., 2010). D'Klassifikatioun vu Broschtkriibs bitt präzis Abléck fir d'Diagnos vu Broschtkriibs an d'Tumorprognose. D'Benotzung vu gemeinsame Biomarker a klinesch-pathologesche Charakteristiken war dat Haaptkriterium fir d'Klassifikatioun vu Broschtkriibs (Tsang an Tse, 2019). D'Prognose an d'Reaktioun op d'Behandlung vu Broschtkriibs gi vu ville Faktoren beaflosst, dorënner d'Präsenz vun Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR), mënschlechen epidermalen Wuestumsfaktorrezeptor 2 (HER2/neu), an histologesche Grad, Tumortyp a Grad. Gréisst a Lymphknäppchenmetastasen (Al-Tubaiti, 2020). Fënnef intrinsesch molekular Ënnertypen vu Broschtkriibs goufen identifizéiert, dorënner luminal A, luminal B, HER2-angeräichert, basalähnlech a claudin-niddreg (Prat et al., 2015). TNBC ass e molekularen Ënnertyp vu Kriibs, deen net all ER, PR an HER2 expriméiert (Yin et al., 2020). Dës pathologesch Charakteristike si mat TNBC assoziéiert, wat seng séier Progressioun a méi aggressiv Natur wéi all aner Aart vu Broschtkriibs bestätegt (Feng et al., 2018). Zousätzlech hunn Peru et al (2000) Microarray-Technologie benotzt fir Broschtkriibs nei ze klassifizéieren a fënnef intrinsesch Ënnertypen vu Broschtkriibs z'identifizéieren (Cadenas, 2012). Basalähnleche Broschtkriibs ass e Ënnertyp vu Broschtkriibs, deen en dräifach negativen Phänotyp huet a mat enger schneller Progressioun assoziéiert ass. Et sollt een drop hiweisen, datt all basalähnlech Broschtkriibs dacks falsch als TNBC diagnostizéiert ginn, awer nëmmen 77% sinn TNBC; Am Géigesaz dozou sinn 71–91% vun den TNBC basalähnlech, wat drop hiweist, datt dës zwou Aarte vu Broschtkriibs sech iwwerlappen a verschidde Klassifikatioune representéieren (Wang D.-Y. et al., 2019). Dëst erstellt e Besoin, d'Heterogenitéit vun TNBC ze charakteriséieren, fir d'Prognose ze klären an potenziell Reaktiounen op aktuell an zukünfteg Behandlungen z'identifizéieren. Zousätzlech mécht TNBC 15–20% vun alle Broschtkriibsfäll aus a kënnt méi dacks bei Fraen ënner 50 Joer vir. BRCA1- oder BRCA2-Mutatioune goufen a ronn 20% vun den TNBC-Fäll gemellt (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studien hunn och gewisen, datt TNBC eng eenzegaarteg immun Mikroumgebung huet, déi héich Niveaue vu vaskuläre endotheliale Wuestumsfaktoren, tumorassoziéierte Makrophagen (TAMs), tumorinfiltréierend Lymphozyten (TILs) an aner Molekülen enthält, déi um Tumorwuesstum a -migratioun bedeelegt sinn. Dofir ass d'Verständnis vum Mikroumgebung vun TNBC entscheedend fir seng Prognose a Behandlung (Fan an He, 2022).
Fir d'Prognose vun TNBC ze bewäerten an eng effektiv Behandlung ze garantéieren, ass eng korrekt Diagnos, haaptsächlech baséiert op Immunhistochemie (IHC) fir ER, PR an HER2 z'entdecken, an eng Mammographie fir Broschtneoplasmen z'entdecken, wichteg. Wéi och ëmmer, d'Mammographie kann intratumoral Charakteristiken wéi Nekrose a Fibrose net adäquat duerstellen (Deepak Singh et al., 2021). Well eng schlecht Prognose an Diagnos d'Dokteren dovun ofhalen, déi richteg Medikamenter ze verschreiwen (Chaudhary, 2020), gi verschidde Strategien agesat fir d'Versuergung vu Patienten mat TNBC ze verbesseren. Aktuell ginn zwou Medikamenter, Doxorubicin a Cyclophosphamid, bei Patienten mat TNBC benotzt a weisen gutt Resultater. Zousätzlech ginn aner Platinmedikamenter agesat, wéi Carboplatin a Cisplatin (Sikov et al., 2015). Zousätzlech goufen PARP-Inhibitoren wéi Olaparib, Velaparib a PF-01367338 als potenziell Chemotherapie fir d'Behandlung vun TNBC agesat (Ishino et al., 2018). Well d'Signalweeër Wnt/b-Catenin, NOTCH an Hedgehog als un der Optriede a Progressioun vun TNBC bedeelegt sinn, kéint d'Zilsetzung vu Medikamenter op dës Weeër eng wichteg Strategie sinn (Aysola et al., 2013). Och wann Chirurgie, Straletherapie a Chemotherapie haut nach ëmmer déi wichtegst Behandlung fir TNBC sinn, goufe bedeitend Fortschrëtter bei der Entwécklung vun neien Behandlungen gemaach, dorënner gezielte Therapie, Immuntherapie, verschidden CRISPR-bezogen Genbearbeitungsinstrumenter wéi Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, Prime Editing a CRISPR/Cas9-gezielte Gentherapie. Hei wäerte mir eis op verschidden CRISPR-bezogen Genbearbeitungsinstrumenter konzentréieren, déi bei der Behandlung vun TNBC benotzt ginn. Dorënner huet CRISPR/Cas9 wäit verbreet Opmierksamkeet kritt.
Cas9n, och bekannt als Cas9 Nickase, ass eng genetesch manipuléiert Variant vum Cas9 Protein, déi vum CRISPR/Cas9 Genom Editing System ofgeleet ass (Gupta et al., 2019). An senger ursprénglecher Form enthält de Cas9 Protein zwou Nuklease-Domänen: RuvC an HNH, deenen hir Haaptfunktioun d'Spaltung vun deenen zwou DNA-Sträng ass. Wéi och ëmmer, am Cas9n ass eng vun den Nuklease-Domänen, HNH, genetesch mutéiert a gëtt inaktiv. Dofir bleift d'HNH-Domän vu Cas9n net funktionell. Nëmmen d'RuvC-Domän bleift aktiv, sou datt Cas9n eenzel DNA-Sträng schneiden oder Bréch kreéiere kann (Trevino a Zhang, 2014). Am Verglach mat Cas9 kann Cas9n Off-Target-Effekter effektiv reduzéieren an d'Zellreparaturmechanismen präzis verbesseren. Cas9n kann benotzt ginn fir verschidde Problemer ze léisen, wéi zum Beispill d'Schafe vu Bréch op spezifesche Plazen an duebelsträngeger DNA. Fir dësen Zweck goufen zwou Cas9n-Moleküle kombinéiert a zesumme benotzt (Yee, 2016). Mixed Lineage Kinase 3 (MLK3) ass eng Mitogen-aktivéiert Proteinkinase, déi als Schlësselregulator während TNBC-Metastasen déngt (Cronan et al., 2012).
MLK3 kann verschidde Signalweeër aktivéieren, déi zu TNBC-Metastasen féieren. Zum Beispill reguléiert de c-Jun N-terminale Kinase (JNK)-Wee d'Zellmotilitéit an den extrazelluläre Matrixofbau, an MLK3 aktivéiert de JNK-Wee, wouduerch d'Zellmotilitéit verbessert gëtt an invasiv Eegeschafte verleiht (Rattanasinchai a Gallo, 2016). MLK3 reguléiert och EMT. Fir dëst ze maachen, aktivéiert et Downstream-Transkriptiounsfaktoren wéi Snail, Slug an Twist. Dës Faktoren hemmen d'Expressioun vun epithelialen Markéierer a förderen d'Expressioun vu mesenchymalen Markéierer, wat zu der Erwerbung vun engem metastatesche Phänotyp féiert (Casalino et al., 2023). Et gouf observéiert, datt MLK3 eng Roll beim ECM-Remodeling an der Aktivéierung vu Proteasen wéi Matrixmetalloproteinasen (MMPs) spillt, déi den ECM ofbauen. Dëst erliichtert d'Invasioun vun Tumorzellen an d'Verbreedung op wäit ewech Plazen (Katari et al., 2019). Dofir hunn fréier Studien gewisen, datt MLK3 eng entscheedend Roll bei TNBC spillt. Rattanasinchai a Gallo hunn TNBC-Modeller benotzt fir d'Roll vun MLK3 ze studéieren a festgestallt, datt et d'Entwécklung vu Kriibs duerch spezifesch Signalweeër fördert. Si hunn CRISPR/Cas9n benotzt fir MLK3 z'änneren an eng bedeitend Reduktioun vun den TNBC-Metastasen observéiert (Rattanasinchai a Gallo, 2016).
dCas9, dacks inaktiv Cas9 genannt, ass eng modifizéiert Derivatform vum Cas9-Protein. Am Géigesaz zum aktive Cas9 huet dCas9 keng Endonukleaseaktivitéit, soudatt et keng DNA-Duebelsträngbréch induzéiere kann. Dofir kann dCas9 benotzt ginn, fir spezifesch Regioune vum Genom präzis unzegräifen, ouni datt d'DNA-Sequenz geännert oder modifizéiert gëtt (Wang et al., 2016). Am dCas9 ginn zwou Endonukleaseproteine, RuvC an HNH, inaktivéiert, andeems wichteg Aminosaierreschter ënnerdréckt ginn. (Richter et al., 2016). Trotz sengem Manktem un DNA-Spaltungsaktivitéit spillt dCas9 eng Rei vu wichtege Rollen an der genetescher Fuerschung an der Biotechnologie. Zum Beispill erlaabt et d'Visualiséierung vu spezifesche Regioune vum Genom, erliichtert d'Transkriptiounsreguléierung a fërdert epigenetesch Modifikatiounen (Brocken et al., 2018).
Den Transkriptiounsfaktor ZEB1 (Zinkfinger E-Box-Bindungshomeobox 1) spillt eng spezifesch a kritesch Roll bei der Vermittlung vum epithel-mesenchymalen Iwwergang (EMT), engem zelluläre Prozess, deen während der embryonaler Entwécklung, der Tissuereparatur an der Kriibsprogressioun stattfënnt. Et ëmfaasst d'Transformatioun vun Epithelzellen a mesenchymal Zellen, wat zu Verännerungen an der Zellmorphologie, der Motilitéit, der Invasivitéit, etc. féiert (Wu et al., 2020). ZEB1 hemmt verschidde Epithelmarkéierer, wéi E-Cadherin an Occludin, déi verantwortlech sinn fir d'Zell-Zell-Adhäsioun an d'Polaritéit vun Epithelzellen an TNBC z'erhalen (Moreno-Bueno et al., 2008). Zousätzlech aktivéiert ZEB1 verschidde Markéierer wéi N-Cadherin, Vimentin a Fibronektin (Konradi et al., 2014) a reguléiert och Genen, déi am Zytoskelett-Remodeling involvéiert sinn, wéi Rho GTPasen a Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), zousätzlech beaflosst et och verschidde Signalweeër wéi den transforméierende Wuesstumsfaktor-β (TGF-β), d'Wnt-Signalgebung, etc., wouduerch d'Tumorinvasioun an d'Metastasen an TNBC gefördert ginn (Chen et al., 2016). Vill Studien a wëssenschaftlech Beweiser weisen drop hin, datt ZEB1 e grousst Potenzial als wäertvollt Mëttel fir d'Detektioun an d'therapeutesch Interventioun vun TNBC huet. An enger rezenter Studie hunn de Waryah et al. en TNBC-Modell benotzt an eng komplett Ënnerdréckung vum ZEB1 duerch dCas9 erreecht. Sou hunn si eng ganz héich Spezifizitéit an eng bal komplett Hemmung vum ZEB1 ënner In-vivo-Konditiounen observéiert (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 ass en Tool fir d'Genbearbechtung mam Numm CRISPR/Cpf1. Et staamt vum CRISPR/Cas-System, wou den Term Cas12 sech op dat CRISPR-assoziéiert Protein 12 bezitt (Bharathkumar et al., 2022), wat komplett ähnlech wéi Cas9 ass. Den eenzegen Ënnerscheed ass, datt et de Cas12-Protein enthält. Am Verglach mat Cas9 huet Cas12 e puer eenzegaarteg Funktiounen, wéi d'Generéiere vu Sticky Ends während dem Genbearbechtungsprozess, während Cas9 stumpf Ends generéiert (Wang et al., 2021). Dës Eegeschaft vu Cas12 dréit zu senger spezifescher DNA-Manipulatiounstechnologie bäi. Als e Protein, dat fäeg ass, d'Zil-DNA präzis ze erkennen an ze schneiden, huet et eng aussergewéinlech Villfältegkeet, wat et zu engem effektive Tool fir eng Vielfalt vun Uwendungen mécht, dorënner och Genbearbechtung (Pickar-Oliver a Gersbach, 2019).
Ähnlech wéi aner CRISPR-Varianten ass CRISPR/Cas12 och fäeg, Genen an TNBC auszeschalten oder z'aktivéieren, andeems se Genen ofzielen, déi eng wichteg Roll an hirer Pathogenese oder Äntwert op d'Behandlung spillen (Yang a Zhang, 2023). Fir dëse Prozess z'erreechen, gouf eng Guide-RNA (gRNA) entwéckelt, déi Cas12 op den Zilgen leet. Soubal Cas12 un säin Zil bindt, féiert et Duebelstrangbréch an der DNA an aktivéiert DNA-Reparaturmechanismen. Wärend dem Reparaturprozess kënne falsch Nukleotiden integréiert ginn, wat zu Genmutatiounen a Funktiounsverloscht féiert (Zhang et al., 2021a). Zousätzlech gouf och eng verbessert Versioun vum Cas12-Enzym (genannt dCas12) benotzt fir Genen z'aktivéieren. Duerch d'Kombinatioun mat engem Transkriptiounsaktivator ass et méiglech, bestëmmt Genen ze induzéieren an doduerch se z'aktivéieren. Dës Technologie huet e grousst Potenzial fir d'Aktivéierung vun Tumorsuppressorgenen ze fërderen (Sultan et al., 2022).
Prime Editing ass eng nei entwéckelt an extrem iwwerleeën Genom-Editing-Technologie. Si ass fäeg, d'DNA vun engem Organismus ganz präzis ze modifizéieren (Chen a Liu, 2023). Prime Editing gëtt duerch d'Integratioun vun zwou Haaptkomponenten erreecht: engem modifizéierten CRISPR/Cas9-Enzym a Reverse Transkriptase. D'Roll vum CRISPR/Cas9-Enzym ass et, präzis Plazen am Genom selektiv unzespriechen, während Reverse Transkriptase hëlleft, d'DNA op der Zilplaz grëndlech ze modifizéieren (Hassan et al., 2021). Am Primer-Editing-Mechanismus ëmfaasst den éischte Schrëtt d'Schafung vun enger Primer-Editing-Guide-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Si enthält d'Zilsequenz an d'RNA-Schabloun, déi dem gewënschten Editiounsplaz an der Zil-DNA entspriechen. D'PegRNA gëtt dann zesumme mat enger Primer-Editing-Nuklease (PE2) an d'Zilzellen agefouert. PE2 ass e Fusiounsprotein, dat aus engem Cas9-Enzym, enger Reverse Transkriptase an engem Primer-Editing-Adapter besteet (Martín-Alonso et al., 2021). Bannent der Zell sichen PegRNA- a PE2-Komplexe no der spezifescher DNA, déi se modifizéiere wëllen. Den Cas9-Enzym schneit d'DNA of a erstellt eng Schabloun, déi aus eenzelne Strécke besteet (Choi et al., 2022). D'Reverse-Transkriptase benotzt dës Schabloun, fir d'DNA fir d'Editioun virzebereeden. Nieft der Kopie vun der DNA sinn och Instruktioune fir d'Editioun vun der RNA-Schabloun abegraff. Schlussendlech gëtt den nei erstallten DNA-Strang als Schabloun benotzt, fir de Broch an der DNA ze reparéieren, wat zu enger verännerter DNA-Sequenz féiert, déi déi gewënschte Modifikatioun enthält (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer-Editiounsmechanismen kënnen zu wäit verbreeten Mutatiounen a Genen féieren. Et kann Punktmutatiounen, Insertiounen, Läsiounen a souguer Gen-Ersatz ofzielen (Anzalone et al., 2019; Chen a Liu, 2023). Prime-Editioun bitt verschidde Virdeeler géintiwwer fréiere Genom-Editiounstechnologien. Dozou gehéieren eng erhéicht Genauegkeet, reduzéiert Off-Target-Effekter an d'Méiglechkeet, DNA z'änneren, ouni op DNA-Duebelstrangbréch ze vertrauen (Anzalone et al., 2020).
D'CRISPR/Cas9 Technologie gouf ursprénglech entwéckelt fir Bakterien virum Plasmidtransfer an der Phaginfektioun ze schützen a gouf spéider als en effektivt RNA-baséiert DNA-Targeting-Tool fir d'Genombearbechtung nei benotzt (Jiang an Doudna, 2017). Zousätzlech gouf bericht, datt de CRISPR/Cas9 System a 50% respektiv 87% vun de bakteriellen an archaesche Genomer präsent ass (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 ass e potenziellt Instrument fir d'Deletioun, d'Insertioun an d'Korrektioun vun all anormaler genetescher Sequenz mat Hëllef vun In-vivo- an In-vitro-Modi (Sabit et al., 2021). Ausserdeem gouf gewisen, datt CRISPR/Cas9 Deel vum adaptiven Immunsystem ass wéinst senger Spezifizitéit fir déi interessant Zilgenen (Chen an Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 besteet aus Cas9 an enger eenzeger Guide-RNA (sgRNA). Cas9 ass eng Endonuklease, déi aus verschiddene Proteinkomponenten zesummegesat ass. Zousätzlech huet Cas9 eenzegaarteg strukturell an konformationell Eegeschaften (Pacesa et al., 2022), well et aus zwou Loben besteet: der Erkennung (REC) an der Nuklease (NUC). D'REC-Lobe ass weider an dräi Regiounen opgedeelt: REC1, REC2 a Bréckhelixen (Cromwell et al., 2018). D'NUC besteet aus dräi Loben, nämlech RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH an dem Protospacer Adjacent Motive (PAM) Interaktiounsdomän (Fig. 1) (Song et al., 2016). D'sgRNA besteet aus zwou Komponenten, dorënner CRISPR RNA (crRNA) an transcodéierend kleng RNA (Tracer RNA) (Figur 1). D'sgRNA verbënnt de Cas9-Protein mat Connexinen, fir en aktiven Komplex ze bilden, deen och als Effektorkomplex bekannt ass (Richter et al., 2012). crRNA ass e Basispaar mat 18–20 Nukleotiden, dat eng entscheedend Roll bei der Erkennung vun Zil-DNA-Sequenzen spillt. Zousätzlech pärt sech crRNA mat der Zil-DNA, an d'tracrRNA wierkt als Gerüst fir d'Cas9-Nuklease, fir d'Zil-DNA ze bannen (Manghwar et al., 2019). Op der anerer Säit huet d'PAM-Sequenz 3 Nukleotiden, wat d'Bindung vum Effektorkomplex un d'DNA bestätegt, spezifizéiert a vermittelt. D'Cas9-Proteinkomplex-Ënnereenheeten RuvC an HNH hunn katalytesch Aktivitéit (Richter et al., 2012; Asmamaw a Zawdie, 2021). Den HNH-Nuklease-Domän vun der Cas9-Ënnereenheet spléckt den DNA-Strang, deen mat der crRNA assoziéiert ass. D'RuvC-Nuklease-Domän spléckt aner DNA-Sträng a generéiert Duebelsträngbréch (DSBs), duerno ginn zwou verschidde Reparaturmechanismen fir DNA-Brëch aktivéiert (Jiang an Doudna, 2017) (Figur 1).
Figur 1. Iwwersiicht iwwer CRISPR/Cas9 (A). Komponenten vum CRISPR/Cas9 System: (i). D'Cas9 Endonuklease ass verantwortlech fir d'Zil-DNA-Sequenz ze schneiden, (ii) eng eenzeg Guide-RNA (sg) déi aus der Fusioun vu crRNA an tra-crRNA Chimären resultéiert. (zwee). Cas9 enthält verschidde Komponenten wéi Rec I, Rec II, NUC-Lobe (HNH a Ruv C sinn Ënnerkomponenten) an PAM Interaktiounsdomän (C) mat entspriechende Funktiounen. De CRISPR/Cas9 Proteinkomplex spalt DNA-Sequenzen an net-komplementär a komplementär Formen (D). CRISPR/Cas9 ännert de Genom an dräi Etappen: Erkennung, Schnëtt a Reparatur. Déi entwéckelt sg-RNA guidéiert Cas9 an erkennt déi gewënscht Sequenz duerch déi komplementär Komponent crRNA. Cas9 erkennt d'PAM-Sequenz op 5′-NGG-3′ a schmëlzt d'DNA, wouduerch en DNA-RNA Hybrid geformt gëtt an d'Spaltung aktivéiert gëtt. Den HNH-Domän vu Cas9 spléckt de komplementäre Strang, an den RuvC-Domän spléckt den net-komplementäre Strang. CRISPR/Cas9 reparéiert duebelsträngeg DNA andeems et op zwou Weeër brécht: net-homolog End Joining (NHEJ) an homologiegeriicht Reparatur (HDR). NHEJ reparéiert duebelsträngeg DNA ouni friem homolog DNA duerch en enzymatesche Prozess, e fehlerufällege Mechanismus, deen zoufälleg DNA-Sequenzen afügen oder ewechhuele kann. HDR ass ganz spezifesch a erfuerdert homolog DNA-Schablounen.
CRISPR/Cas9-vermittelte Reparaturweeër enthalen net-homolog End Joining (NHEJ) a homologiegeriicht Reparatur (HDR) Mechanismen. NHEJ ass e fehlerufällege Wee, well en Insertioun oder Deletioun involvéiert a kee Muster während dem Reparaturmechanismus erfuerdert. E benotzt zoufälleg Nukleotiden fir Standardproteinen ze generéieren (Abbasi et al., 2021). Dëst Reparatursystem besteet aus véier Komplexer wéi de KU-Komplex, de Kräizkomplementéierungsproteinkomplex Typ 4 (XRCC-4), den DNA-Endveraarbechtungsenzym an d'Proteinkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). De KU-Komplexprotein huet zwou Ënnereenheeten, Ku 70 a Ku 80, a spillt eng wichteg Roll am NHEJ-Mechanismus, well de Reparaturmechanismus duerch d'Bindung vun zwou Ënnereenheeten (Ku 70 a Ku 80) un déi stumpf oder bal stumpf Enden vun der Zil-DNA initiéiert gëtt (Abbasi et al., 2021), déi als Gerüst déngen, fir aner NHEJ-bezogen Faktoren op d'Plaz vun der Verletzung ze rekrutéieren (Yang et al., 2020). XRCC-4 an DNA-Ligase bestinn aus 334 respektiv 911 Aminosäuren, an den XRCC4-DNA-Ligase IV-Komplex stimuléiert d'Ligatioun vun DNA-Enden (Chatterjee et al., 2015). DNA-Endveraarbechtungsenzym, och bekannt als Polynukleotid-Kinase 3'-Phosphat, ass en DNA-Endveraarbechtungsenzym. Et kann d'3'P-Grupp an der DNA ewechhuelen an d'5'OH-Grupp während der DSB-Reparatur phosphoryléieren. Et ëmfaasst och d'Reparatur vun Eenzelstrangbréch (SSBs) mat Hëllef vum SSB-Reparaturwee (Chatterjee et al., 2015). Proteinkinase DNA-PKcs ass eng DNA-ofhängeg Proteinkinase, déi aus enger katalytescher Ënnereenheet vun de PIKKs (Phosphatidylinositol 3-Kinase-related Kinases) an der Ataxia Telangiectasia mutated (ATM) Famill besteet, souwéi ATM- an Rad3-related ATRs, Strangbréch (DSBs) an Eenzelstrangbréch (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR ass e méi präzisen a passenden Reparaturmechanismus, well d'Informatioun mat der intakter Form vum homologen DNA-Duplex kopéiert gëtt, obwuel et d'Präsenz vu Schwësterchromatiden erfuerdert. Dëst geschitt während der S/G2-Phase vum Säugetierzellzyklus. HDR trëtt haaptsächlech a Hefaarten op, awer NHEJ ass kritesch bei Säugetieren (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). De komplette Reparaturmechanismus gëtt an der Figur 1 gewisen.
Well TNBC duerch genetesch an epigenetesch Anomalien verursaacht gëtt, kéint d'Korrektioun vu bösartigen genomeschen/epigenomeschen Anomalien mat CRISPR/Cas9 eng vernünfteg therapeutesch Approche sinn (Chen et al., 2019). Zousätzlech kënnen e puer Transkriptiounsfaktoren, déi an der zellspezifescher Transkriptiounsreguléierung involvéiert sinn, eenzegaarteg Charakteristike vu Kriibszellen opweisen, wat drop hiweist, datt d'Transkriptiounsreguléierung eng exzellent Approche fir d'Kriibsbehandlung kéint sinn (Drost et al., 2017). D'Ausnotzung vun dëse molekulare Charakteristike vun Tumoren, wéi genetesch, epigenetesch an transkriptionell Defekter, fir d'Entwécklung vu Medikamenter kann d'klinesch Resultater verbesseren an d'Screeningkäschte reduzéieren. CRISPR ass e potenziellt Genbearbeitungsinstrument, dat net nëmmen kriibserreegend genomesch Ziler erkennen an identifizéiere kann, mä och benotzt ka ginn, fir Onkogenen an mënschlechen Zellen z'änneren, z'ënnerdrécken an epigenetesch ze modifizéieren (Tabell 1) (Ahmed et al., 2021). Verschidde CRISPR-Screening goufen duerchgefouert, fir no Genen ze sichen, déi mat Tumorsuppressoren, Onkogenen a Medikamentenresistenz assoziéiert sinn. D'Benotzung vu CRISPR/Cas9 fir verschidden TNBC-Onkogenen ze modifizéieren ass an der Figur 2 gewisen.
Figur 2. Genmodifikatioun vu verschiddenen TNBC-Onkogenen mat CRISPR/Cas9, wat zu engem reduzéierten Tumorwuesstum a Metastasen féiert. Dës Onkogenen enthalen CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 a CXCR7, Crypto1, ROR1 an ST8SIA, déi um Optriede a Metastase vun TNBC bedeelegt sinn.
Kriibszellmigratioun, Invasioun an epithelial-mesenchymal Iwwergang (EMT) si mat ITGA9 assoziéiert. Fréier Studien hunn gewisen, datt ITGA9 e Schlësselspiller am Notch-Signalwee ass a spillt eng interessant Roll bei der Rhabdomyosarkom-Metastas (Molist et al., 2020). Zousätzlech gouf festgestallt, datt ITGA9 enk mat der Patientprognose a verschiddene Tumortypen assoziéiert ass, dorënner Broschtkriibs (Wang Z. et al., 2019). Zousätzlech huet d'Bioinformatikanalyse vun ITGA9 gewisen, datt seng Expressioun an TNBC däitlech méi héich war wéi an anere Broschtkriibs-Ënnertypen. Erhéicht ITGA9-Niveaue si mat Tumormetastasen a Réckfäll bei TNBC-Patienten assoziéiert. Den Knockout vun ITGA9 duerch CRISPR/Cas9 huet zu Kriibsstammzell- (CSC)-ähnlechen Eegeschaften, Tumorangiogenese, Tumorwuesstum a reduzéierter Metastaséierung gefouert, andeems den β-Catenin-Degradatioun an TNBC gefördert gouf (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 ass e Member vun der TGF-β Famill a spillt eng wichteg Roll fir déi fréi Embryogenese, d'Erhale vu Stammzellen a Kriibsmetastasen (Ishii et al., 2021). Och bekannt als Tdgf-1, ass et en onkogenes GPI-verankert Signalprotein, dat un der Reguléierung vun der Bildung vum Primitive Streak, Mesoderm an Endoderm bedeelegt ass, souwéi un der Etabléierung vun enger lénks/riets Asymmetrie an der Entwécklung vu Kierperorganer während der Embryogenese (Zhang et al., 2021b). Zousätzlech gouf gewisen, datt Cripto-1 am epithelial-mesenchymalen Iwwergang (EMT) als Stammzellmarker bedeelegt ass (Zhang et al., 2021b). EMT ass net nëmme fir verschidde Prozesser wéi Embryonal Entwécklung, Fibrose a Wonnheilung entscheedend, mä och fir Kriibsinvasioun a Metastasen. Zousätzlech gouf gewisen, datt Cripto-1 mat véier Notch-Rezeptoren interagéiert an hir posttranslational Reifung verbessert (Brandstadter a Maillard, 2019). Et ass bekannt, datt den Notch-Signalwee un der Erhaalung vu mënschleche Broschtkriibszellen bedeelegt ass. Studien hunn gewisen, datt de CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout vu Crypto-1 de Kriibswuesstum an d'Metastaséierung ënnerdréckt. Dofir kéint Crypto-1 e wichtegt therapeutescht Zil fir TNBC ginn (Castro et al., 2015).
Den XCL12-Protein a säi Chemokinrezeptor CXC (CXCR4 an CXCR7) spille verschidde Rollen an der Proliferatioun, dem Wuesstum, der Migratioun an der Invasioun vu Kriibszellen (Wu et al., 2015). Dës Chemorezeptoren goufen duerch verschidde Signalweeër souwuel an In-vivo- wéi och an In-vitro-Modeller mat der Entwécklung vun TNBC a Verbindung bruecht (Wu et al., 2015). Zousätzlech ass d'Aktivéierung vu CXCR4 an CXCR7 mat enger méi grousser Ufällegkeet fir Metastasen an enger schlechter Prognose bei TNBC a Verbindung bruecht (Karn et al., 2022). Dofir kéint den Knockout vu CXCR4 an CXCR7 effektiv Medikamentenzielgenen fir d'Behandlung vu Broschtkriibs, dorënner TNBC, ginn. Eng Studie vum Yang et al. Yang et al. (2019) huet CRISPR/Cas9 benotzt fir d'CXCR4- an CXCR7-Genen zesummen ze knockouten a festgestallt, datt d'Proliferatioun, d'Wuesstum, d'Migratioun an d'Invasioun vun TNBC signifikant inhibéiert goufen (Yang et al., 2019).
Erhéicht Niveaue vu miR-3662, engem TNBC-Onkogen, goufen a Broschtkriibsgewebe observéiert (Yi et al., 2022). Et gouf gewisen, datt den Knockdown vu miR-3662 de Wuesstum an d'Metastaséierung vu Broschtkriibstumoren souwuel in vivo wéi och in vitro hemmt (Agarwal a Gupta, 2021). HBP-1 ass e potenten Inhibitor vun der Wnt/-Catenin-Signalgebung a wahrscheinlech verantwortlech fir de miR-3662-vermittelte Wuesstum vun TNBC-Zellen. Viru kuerzem hunn Yi et al. festgestallt, datt d'miR-3662-HBP1-Achs de Wnt/-Catenin-Signalwee an TNBC-Zellen reguléiert (Yi et al., 2022). Wéinst senger tumorspezifescher Expressioun kéint miR-3662 e potenziellt therapeutescht Zil fir TNBC sinn. Dofir kéint den CRISPR/Cas9-vermittelten Knockdown vu miR-3662 eng exzellent Approche fir d'Entwécklung vun neie Medikamenter fir d'Behandlung vun TNBC sinn.
UBR5 ass en 300 kDa grousst Nukleophosphoprotein, dat als Schlësselregulator vun der Tumorgenese, der Metastaséierung an der Immunantwort bei verschiddene Kriibsarten identifizéiert gouf (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Et gouf bericht, datt UBR5 an TNBC-Prouwen staark eropreguléiert ass a stimuléiert d'ERα-Funktioun andeems et d'Proliferatioun duerch seng Ubiquitin-Ligase-Aktivitéit induzéiert (Bolt et al., 2015). Studien zur Sequenzéierung vun der ganzer Exom vu primäre TNBC-Prouwen hunn och eng erhéicht Expressioun vun UBR5 gewisen, wat op seng Roll an der Entwécklung vun TNBC hiweist. Zousätzlech huet d'CRISPR/Cas9-gedriwwe Läschung vun UBR5 eng bedeitend Hemmung vun der TNBC-Metastaséierung a vum Wuesstum an experimentellen Mausmodeller gewisen. Ausserdeem huet d'Inklusioun vun UBR5 an engem Wildtyp-Mausmodell seng voll Funktionalitéit restauréiert, während dësen Effekt net an inaktivéierte Mutantstämme observéiert gouf (Liao et al., 2017). De Mangel un UBR5 gëtt mat erhéichter Apoptose, Nekrose an Hemmung vum Tumorwuesstum bei TNBC wéinst enger schlechter Angiogenese a Verbindung bruecht. Wéinst dem Verloscht vun UBR5 gëtt d'Tumorverbreedung op wäit ewech Organer reduzéiert, an UBR5 induzéiert anormal EMT haaptsächlech andeems d'E-Cadherin-Expressioun reduzéiert gëtt (Zhang a Weinberg, 2018). Viru kuerzem gouf gewisen, datt UBR5 e ganz wichtege Faktor bei der IFN-γ-induzéierter PDL1-Transkriptioun bei TNBC ass wéinst sengem Manktem un E3-Ubiquitinatiounsaktivitéit. D'RNA-Transkriptomanalyse huet gewisen, datt UBR5 systemesch Auswierkungen op Genen huet, déi mam IFN-γ-Wee verbonne sinn, an d'PDL1-Transaktivatioun fördert andeems d'Aktivéierungsniveauen vun der Proteinkinase-RNA (PKR) an hiren Signaltransduceren an Aktivatoren erhéicht ginn, Transkriptioun 1 (STAT1) an Interferon-Reguléierungsfaktor 1 (IRF1). Wéi och ëmmer, huet déi kombinéiert Ablatioun vun der UBR5- an PD-L1-Expressioun duerch CRISPR/Cas9 e synergisteschen therapeuteschen Effekt wéi all Blockad eleng, mat déifgräifenden Auswierkungen op d'Tumor-Mikroëmfeld (Wu et al., 2022). Dofir kéint CRISPR/Cas9 e wichtegt Instrument sinn, fir d'UBR5-Funktioun ze hemmen an doduerch TNBC-Metastasen an Tumorwuesstum z'ënnerdrécken.
ROR1 ass en Typ I Transmembranprotein, dat während Kriibs an der embryonaler Entwécklung expriméiert gëtt a gouf als onkofetalt Protein identifizéiert (Nicholas Borcherding, 2014). Dat invasivt Verhalen vu verschiddene mënschleche Kriibsarten ass mat enger Upreguléierung vum ROR1 assoziéiert. Villverspriechend Resultater goufen aus In-vivo- an In-vitro-Studien mat therapeutesche Verbindungen, déi op ROR1 abzielen, kritt (Chien et al., 2016). Erhéicht Niveauen vun ROR1 mRNA a Broschtgewebebiopsien goufen och mat aggressiven basalähnlechen Broschttumoren (BL) an hirer Migratioun an aner Deeler vum Kierper assoziéiert. Ausserdeem gouf d'Iwwerexpressioun vu ROR1 als prognostische Marker fir d'Entwécklung vun TNBC identifizéiert (Chien et al., 2016). Wéi och ëmmer, d'Ausschalten vu ROR1 mat CRISPR/Cas9 fir TNBC-Wuesstum an Metastasen z'ënnerdrécken wier eng effektiv Strategie.
De Sialylierungsprozess ëmfaasst d'Zousätzlech vu Sialinsäure zu Glykokonjugaten, wat duerch Sialyltransferasen (STs) katalyséiert gëtt. ST8SIA1 gehéiert zu der ST-Famill a spillt eng wichteg Roll an der Pathogenese vu verschiddene Krankheeten, wéi lymphozytärer Leukämie a Darmkriibs (Chang et al., 2018). RNA-Sequenzanalyse weist, datt ST8SIA1 staark am Broschtgewebe vu TNBC-Patienten expriméiert gëtt a positiv mat Mutatiounen am Tumorsuppressorgen p53 korreléiert ass, wat zu der Pathogenese vun TNBC bäidroe kann (Battula et al., 2017). Zousätzlech ass ST8SIA1 un der Metastaséierung an dem Rezidiv vun TNBC bedeelegt, wat drop hiweist, datt et eng wichteg Roll beim Optriede an der Entwécklung vun TNBC spillt. An engem In-vitro-Modell vun TNBC gouf gewisen, datt den Knockdown vun ST8SIA1 duerch CRIPSR/Cas9 de Wuesstum an d'Metastaséierung blockéiert (Battula et al., 2017). Dëst weist drop hin, datt CRISPR/Cas9 e wichtegt Instrument fir d'Hemmung vun der Funktioun vum ST8SIA1-Onkogen bei der Behandlung vun TNBC kéint sinn.
NAT1 ass en metabolescht Enzym, dat d'Bildung vu Phase-II xenobiotesche Verbindungen katalyséiert a bal an all mënschleche Gewëss expriméiert gëtt. NAT1 kann de Cofaktor Folat benotze fir Acetyl-CoA (Acetyl-CoA) unzegräifen, och ouni den aromateschen Aminsubstrat (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studien hunn gewisen, datt NAT1 d'Funktioun vun der Matrixmetalloproteinase 9 (MMP9) a Broschtkriibszellmodeller reguléiert a géint reaktiv Sauerstoffspezies (ROS) während Glukosmangel schützt (Wang et al., 2018). D'Läschung vun NAT1 huet gewisen, datt se de Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex hemmt, wat zu enger mitochondrialer Dysfunktioun féiert (Wang L. et al., 2019). Zousätzlech hunn verschidden aner Berichter gewisen, datt d'NAT1-Inhibitioun mat Hëllef vu klenge Molekülen a siRNA-Silencing d'Invasivitéit a Proliferatioun vu Broschtkriibszellen reduzéiere kann (Stepp et al., 2018). Viru kuerzem gouf CRISPR/Cas9 benotzt fir NAT1 an der Broschtkriibszelllinn MDA-MB-231 z'ënnerdrécken, wat de Zellmetabolismus jee no sengem Expressiounsniveau beaflosst. Dës Studie huet och gewisen, datt NAT-1 entscheedend fir d'Progressioun an d'Metastaséierung vun TNBC ass (Carlisle et al., 2020).
D'koordinéiert Transkriptioun vun Onkogenen gëtt duerch Superenhancer, Transkriptiounsfaktoren a Kofaktoren reguléiert (Hnisz et al., 2015). Zousätzlech ass eng Grupp vu Cyclin-ofhängegen Kinasen (CDKs), wéi CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 an CDK13, fir d'Transkriptiounsreguléierung noutwendeg. Dorënner ass CDK7 un der Phosphoryléierung vun der RNA-Polymerase II bedeelegt, wat ganz wichteg ass fir d'Initiatioun an d'Expansioun vun der Onkogen-Transkriptioun an der Pathogenese vun TNBC. An enger wichteger Studie huet d'Deletioun vun CDK7 duerch CRISPR/Cas9 TNBC inhibéiert, wat drop hiweist, datt d'Pathogenese vun TNBC CDK7-ofhängeg ass (Wang Y. et al., 2015).
Studien hunn gewisen, datt Mutatiounen am MYC an RBP (RNA-bindend Protein) zu Apoptose féiere kënnen, während eenzel Genmutatiounen am MYC oder RBP keen Afloss op d'Wuesstum vu Kriibszellen hunn (Einstein et al., 2021). Méi wéi 1000 RBPs am mënschleche Genom goufen mat enger CRISPR/Cas9-baséierter Bibliothéik gescreent. Dorënner goufen 57 RBPs als kritesch fir d'Wuesstum vu Kriibszellen mat héich erhéichte MYC-Niveauen fonnt (Wheeler et al., 2020). Zousätzlech ass YTHDF2 wichteg fir d'Erhalen vum TNBC-Zellwuesstum a reduzéiert d'Quantitéit vun methyléierten Transkripten während der Transkriptioun an der Translatioun op héijem Niveau a Kriibszellen mat méi héijer MYC-Expressioun. Zousätzlech ass YTHDF2 net essentiell fir Kriibszellen, déi manner ofhängeg vun erhéichte MYC-Niveauen sinn, fir d'Iwwerliewe vun TNBC-Patienten ze verlängeren (Einstein et al., 2021), wat drop hiweist, datt et e potenziellt therapeutescht Zil fir Medikamenter kéint sinn, déi TNBC iwwerwanne kënnen.
Zinkfangerproteine (ZNFs) maachen ongeféier 1% vum gesamte mënschleche Genom aus. Studien hunn gewisen, datt ZNF d'Zellproliferatioun a verschiddene Kriibsarten, wéi Liewerkriibs, Broschtkriibs a Darmkriibs, reguléiere kann (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliothéiken, déi duerch CRISPR-Knockout generéiert goufen, goufen benotzt fir verschidden Tumorsuppressorgenen (TSGs) a Broschtkriibszellen ze screenen (Shalem et al., 2014). Zënterhier huet eng transkriptomesch Studie vu CRISPR/Cas9 ZNF319-geläschte Broschtkriibszellen gewisen, datt ZNF319 en Tumorsuppressorgen ass, dat d'Broschtkriibsproliferatioun reduzéiert an dofir a verschiddene potenziellen Signalmechanismen an aner biologesch Funktiounen involvéiert ass (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose ass eng Aart vu programméiertem Zelltod, deen vun der Präsenz vun Eisen ofhängeg ass. Et ass bekannt, datt d'Entwécklung vu Ferroptose vun der Präsenz vu Lipidperoxiden beaflosst gëtt. Zousätzlech gouf bericht, datt PKCβII eng fréi Lipidperoxidatioun weist, an eng erhéicht Lipidperoxidatioun ass mat Ferroptose assoziéiert. D'Screening vun enger Bibliothéik vu CRISPR/Cas9-vermittelten Kinase-Inhibitoren huet gewisen, datt PKCβII um Prozess vun der Lipidperoxidatioun bedeelegt ass, wat entscheedend fir Ferroptose an MDA-MB-231 Zellen ass (Zhang et al., 2022). Dofir weist dëst drop hin, datt den Knockout vu PKCβII duerch CRISPR/Cas9 e potenziellt Tumorsuppressorgen-Zil fir d'Behandlung vu Ferroptose-verwandte Krankheeten kéint sinn (Zhang et al., 2022).
Et gëtt ugeholl, datt Medikamentenresistenz fir ongeféier 90% vun den Doudesfäll bei Kriibspatienten verantwortlech ass an eng vun den Haaptproblemer an der Kriibsbehandlung ass (Bukowski et al., 2020). D'Resultater weisen drop hin, datt eng genuch Zuel vu Genen, déi mam Medikamenten-Efflux, der DNA-Reparatur, der Apoptose a verschiddene Zellsignalweeër zesummenhänken, mat Medikamentenresistenz assoziéiert sinn (Haider et al., 2020). Dorënner goufen e puer Genen vu CRISPR/Cas9-Tools gezielt an hunn villverspriechend Resultater bei der Reduktioun vun der Medikamentenresistenz an der Erhéijung vun der Effizienz vun Antikriibsbehandlungen gewisen (Vaghari-Tabari et al., 2022). Zousätzlech goufen High-Throughput CRISPR/Cas9 Gen-Knockout-Screeningbibliothéike mat der Modifikatioun vun der Funktioun vu potenziellen Medikamentenresistenzgenziler implizéiert (Shalem et al., 2015). Fir Paclitaxel-Resistenzgenen z'identifizéieren, gouf RNA-Sequenzéierung gekoppelt mat genomwäitem sgRNA-Bibliothéiksscreening benotzt fir aacht Kandidatengenen z'identifizéieren, dorënner Histondeacetylase 9 (HDAC9), déi mat Medikamentenresistenz bei Patienten mat rezidivéierender TNBC assoziéiert sinn (B et al., 2020). An enger anerer Studie gouf eng erhéicht Expressioun vun Diserin/Threonin a Tyrosinproteinkinase (DSTYK) während dem Iwwerliewe vun TNBC-Patienten observéiert, déi mat Antikriibsmedikamenter behandelt goufen. Ausserdeem huet de CRISPR/Cas9-vermittelten Knockdown vun DSTYK d'Apoptose vu medikamentresistente Kriibszellen in vitro (SUM102PT-Zellen an MDA-MB-468-Zellen) an engem in vivo TNBC-Modell signifikant verbessert (Ogbu et al., 2021).
Obwuel TNBC eng anormal Aktivatioun vum MAPK-Signalwee huet, ass de klineschen Effekt vun MEK-gezielten Therapien schlecht. E CRISPR/Cas9 Genombibliothéiksscreening huet gewisen, datt d'Inhibitioun vu PSMG2 (Proteom-Assembléierungs-Chaperon 2) d'TNBC BT549- an MB468-Zellen op den MEK-Inhibitor AZD6244 sensibiliséiert. Den CRISPR/Cas9 Knockdown vu PSMG2 huet déi normal Proteasomfunktioun verännert, wat zu enger Autophagie-vermittelter Demontage vu PDPK1 féiert, wouduerch d'Tumorzellen an TNBC-Mausmodeller, déi duerch AZD6244 (MEK-Inhibitor) an MG132 (Proteasom-Inhibitor) induzéiert goufen, weider verbessert ginn. Dofir kënnen Proteasom- an MAP-Kinase (MEK)-Inhibitoren synergistesch verabreicht ginn, fir d'Tumorzellproliferatioun ze reduzéieren (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 gouf och benotzt fir de Verloscht vun der Genfunktioun z'ënnersichen, wat zu TNBC-Resistenz féiert (Shu et al., 2020). Ge et al. hunn de Mechanismus vun der Medikamentenresistenz vu Kriibszellen erkläert, déi mat JQ1, engem BET-Bromodomain-Inhibitor (BBDI), bei TNBC behandelt goufen. Mat CRISPR/Cas9 hunn si festgestallt, datt d'Läschung vum rb1-Gen dozou gefouert huet, datt TNBC resistent géint dat Antikriibsmedikament JQ1 gouf. Dofir ass d'rb1-Funktioun wichteg an der Äntwert op JQ1-Medikamenter bei TNBC. Si hunn och bericht, datt Paclitaxel en CDK4/6-Kinase-/Mikrotubuli-Inhibitor ass, a seng Kombinatioun mat BBDIs wéi JQ1 kéint villverspriechend therapeutesch Äntwerten op medikamentresistente TNBC liwweren (Ge et al., 2020).
Et gouf bericht, datt d'Transkriptiounslandschaft vu laanger net-kodéierender RNA (lncRNA) verantwortlech ass fir d'Resistenz géint neoadjuvant Therapie bei TNBC. Dës Studie weist, datt fënnef verschidde MALAT1 lncRNA Transkripten an TNBC staark expriméiert ginn. Zousätzlech huet d'CRISPR/Cas9-vermittelte Läschung vu MALAT1 d'Sensibilitéit vun TNBC BT-549 Zellen op Paclitaxel an Doxorubicin erhéicht, wat op eng potenziell Roll fir MALAT1 Resistenz bei TNBC hiweist (Shaath et al., 2021).
Mutatiounen am BRCA1 (BRCA1m) si heterogen an dofir schwéier z'entdecken. D'Zilsetzung vun PARP1 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase), dem syntheteschen lethalen Partner vum BRCA1, kéint d'Chemosensitivitéit vun TNBC-Medikamenter erhéijen. Mat CRISPR/Cas9 huet d'Deletioun vum PARP1 d'Sensibilitéit vun Antikriibsmedikamenter wéi Doxorubicin, Gemcitabin an Docetaxel op mBRCA1-mutant TNBC-Zellen erhéicht, wat drop hiweist, datt PARP1 och un der Medikamentenresistenz am TNBC bedeelegt ass (Vaghari-Tabari et al., 2022). Et ass bekannt, datt Mutatiounen an den Tumorsuppressorgenen BRCA1 oder BRCA2 d'Wahrscheinlechkeet erhéijen, Broschtkriibs bei Leit z'entwéckelen. D'Behandlung vun dëse Patienten erfuerdert d'Benotzung vu PARP-Inhibitoren. Zousätzlech gouf et gewisen, datt den Knockout vum Nukleotid-Salvagefaktor DNPH1 mat Hëllef vu CRISPR/Cas9 de gëftege Nukleotid 5-Hydroxymethyldeoxyuridin (hmdU)-Monophosphat ewechhuele kann, wouduerch d'Reaktioun vu BRCA-defizienten Zellen op d'Sensibilitéit fir PARP-Inhibitoren verbessert gëtt (Fugger et al., 2021). Dofir kéinten CRISPR/Cas9 an PARP1-Inhibitoren eng wichteg Behandlungsstrategie fir TNBC ginn.
De penetrant Glykoprotein (P-gp) Gen ass e Multidrug Resistenzgen, dat allgemeng a ronn 41% vun allen TNBC eropreguléiert ass (Sun et al., 2020). P-gp-induzéierten Medikamenten-Efflux gouf als Schlësselregulator vun der Medikamentenresistenz bei Broschtkriibs identifizéiert. P-gp-Inhibitoren hunn eng erhéicht Empfindlechkeet fir Antikriibsmedikamenter bei Broschtkriibs gewisen (Famta et al., 2021). Dofir kéint d'CRISPR/Cas9-vermittelte Ablatioun oder Ënnerdréckung vu P-gp an P-gp-Inhibitoren ganz wichteg Methode sinn, fir d'Medikamentenresistenz bei TNBC ze iwwerwannen.
Den ATP-bindende Kassettentransporter G2 (ABCG2) ass bekannt dofir, datt en Medikamentenresistenz bei TNBC verursaacht (Palasuberniam et al., 2015), obwuel et de Moment keng Berichter iwwer d'Bezéiung tëscht CRISPR/Cas9 an ABCG2-Silencing an der Inaktivéierung vum Tumorsuppressorgen gëtt. PTEN kann d'ABCG2-Aktivéierung verbesseren (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Dofir kéint d'Benotzung vu CRISP/Ca9 fir ABCG2 ze entfernen an et mat engem ABCG2-Inhibitor ze kombinéieren eng gëeegent Behandlung sinn, fir d'Medikamentenresistenz bei TNBC ze iwwerwannen. Tabelle 2 ernimmt CRISPR/Cas9, deen all Resistenzgenen ofzielt.
Tabelle 2. CRISPR/Cas9 zielt op verschidde TNBC-Resistenzgenen of, fir Zellen op Antikriibsmedikamenter ze sensibiliséieren.
CRISPR/Cas9-Bibliothéike si potenziell Instrumenter fir d'Screening vu Genmutatiounen, déi mat der Kriibspathogenese verbonne sinn (Chan et al., 2022). Dës Screeningmethod ëmfaasst véier Schrëtt wéi (a) Bibliothéikskonstruktioun, (b) lentiviral Transduktioun, (c) phenotypescht Screening an (d) Zilgenanalyse. Och wann TNBC eng anormal Aktivatioun vum MAPK-Signalwee huet, ass d'klinesch Prognose vun enger gezielter MEK-Therapie fir TNBC-Patienten, déi Mutatiounen an Tumorsuppressorgenen wéi PTEN, RB1 an TP53 droen, ganz schlecht.
Zousätzlech gouf e Gen-Knockout-Screening mat CRISPR/Cas9 dat potentst a selektivst Molekül, Dehydrocatrol, getest, wat a guatemaltekesche Blummen- an Bliederextrakter reichlech virkënnt, fir den Effekt vun Dehydrocatrol op MDA-MB-231 ze verstoen. Mechanismen vun der selektiver Zellzytotoxizitéit. Mesenchymal Stammheetscharakteristike vun TNBC-Subtypen. Dëse CRISPR/Cas9-baséierte Screening huet och opgedeckt, datt HSD17B11, e Gen, dat 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 11 kodéiert, an MDA-MB-231-Zellen staark expriméiert gëtt a fir MDA-MB-231-Zellen spezifesch Dehydrofalcarinol resultéiert (Grant et. al., 2020). Dëst weist also drop hin, datt de CRISPR/Cas9-Genomscreening e grousst Potenzial huet fir d'Mechanismen z'identifizéieren, déi den Antikriibs-Eegeschafte vu potenziellen natierleche Verbindungen zugronn leien.
Zousätzlech gouf d'Vulnerabilitéit vun TNBC fir Kriibs mat Hëllef vun engem objektiven genomwäiten In-vivo CRISPR/Cas9-Screening ënnersicht, deen e Lien tëscht onkogenen an Tumorsuppressor-Weeër gewisen huet. Et gouf bericht, datt Schlësselkomponente vun den mTOR- an Hippo-Weeër eng wichteg Roll an der Tumorreguléierung bei TNBC spillen. Zousätzlech hunn Studien gewisen, datt d'pharmakologesch Hemmung vun mTORC1/2 an YAP-Onkoprotein effektiv d'Pathogenitéit vun TNBC mat Hëllef vun engem In-vitro-Medikamenten-Matrix-Synergiemodell an In-vivo-Xenograften, déi vu Patienten ofgeleet ginn, hemmt. Ausserdeem verstäerkt d'Torin-1-vermittelte mTORC1/2-Hemmung d'Makropinozytose, während d'Verteporfin-induzéiert YAP-Hemmung zum TNBC-Zelltod féiert. Zesummegeholl ënnersträichen dës Resultater d'Kraaft a Robustheet vum genomwäiten In-vivo CRISPR-Screening fir nei an effektiv Behandlungen fir TNBC z'identifizéieren (Dai et al., 2021).
Eng Dysreguléierung vum Immunsystem ass e wichtege Faktor bei der Tumorgenese. Kriibszellen entzéien der Immunclearance andeems se Verteidegungsmechanismen ëmgoen, dorënner d'Aktivitéit vun den Immunzellen am Tumor-Mikroëmfeld ze stéieren an den Immunsystem ze kompromittéieren. Dofir kann d'Entwécklung vun engem verbesserten Immunsystem e Schlësselansatz fir de Kampf géint Tumoren sinn. D'Benotzung vun der CRISPR/Cas9-baséierter Genmodifikatioun adresséiert verschidde Problemer am Zesummenhang mat der Immundysfunktioun aus verschiddene Perspektiven. CRISPR/Cas9 gouf benotzt fir d'Antitumorimmunitéit géint Broschtkriibs duerch déi folgend Weeër ze verbesseren (Figur 3).
Figur 3. CRISPR/Cas9 Immuntherapie zielt op TNBC-Zellen of. De Verloscht vun CDK5 an den Downdown vu PDL1 an CD155 stäerken den Immunsystem. Och de Verloscht vun A2AR an den Downdown vun TAAen wéi HER2, Mucin 1 an TEM8 hunn d'Effizienz vun de CAR-T-Zellen beim Töten vu Kriibszellen erhéicht. CRISPR/Cas9-gedriwwen T-Zell-Screening huet gewisen, datt d'Stéierung vun der p38-Kinase d'Antitumoraktivitéit vun den T-Zellen erhéicht. T-Zellen, déi duerch CRISPR/Cas9 modifizéiert sinn, erhéijen d'Expressioun vun TCR (T-Zell-Rezeptor), wat zu T-Zellen féiert, déi Antitumoraktivitéit hunn.
D'Zil vun der Immuntherapie ass et, den Immunsystem ze stimuléieren, Kriibszellen unzegräifen. Iwwerexpressioun vun Immun-Checkpoint-Proteinen verhënnert normalerweis Autoimmunreaktiounen, kann awer Kriibs hëllefen, se ze vermeiden (Topalian et al., 2015). Dës Proteine verhënneren Immunreaktiounen andeems se sech un Rezeptoren op der Uewerfläch vun Immunzellen binden. Verschidde Checkpoint-Proteinen (wéi CD155 an PD-L1) viséieren den PD-1-Rezeptor op Immunzellen a ginn a Broschtkriibs, besonnesch TNBC, expriméiert (Li Y.-C. et al., 2020). D'Ofschwächung vu PD-L1 oder sengem Rezeptor mat Hëllef vu CRISPR/Cas9 kann den Immunsystem stimuléieren, TNBC-Tumoren unzegräifen (Yahata et al., 2019). Zousätzlech gouf gewisen, datt d'Downreguléierung vun der PD-L1-Expressioun duerch CRISPR/Cas9-vermittelte Läschung vu CDK5 den Tumorwuesstum in vitro an in vivo hemmt (Deng et al., 2020). D'Wuestumshemmung an In-vitro- an In-vivo-Modeller vu Broschtkriibs weist drop hin, datt d'shRNA-vermittelte Reduktioun vum CD155 en therapeuteschen Effekt op Broschtkriibs kéint hunn (Gao et al., 2018).
CAR T-Zellen expriméieren CARen, déi tumorassoziéiert Antigenen (TAAs) erkennen a kënnen den Knockdown vu Checkpointproteinen benotze fir hir Aktivitéit ze verbesseren (Li C. et al., 2020). Et gëtt verschidde potenziell Ziler fir CAR T-Zelltherapie bei Broschtkriibs, dorënner verschidde TAAs wéi HER2, Mucin1 an TEM8 (Bajgain et al., 2018). Et gëtt Beweiser datt CAR T-Zellen, déi op Mesothelin (iwwerdriwwen an TNBC BT-459 Zellen) abzielen, méi effektiv géint Kriibs sinn, wann PD-1 mat CRISPR/Cas9 ausgeschalt gëtt (Hu et al., 2019). Wéi och ëmmer, d'Isolatioun vun T-Zellen vu Patienten an hir dann ex vivo ze modifizéieren ass e schafftintensiven an zäitopwännege Prozess. Och wann universell T-Zellen d'Isolatiounsufuerderunge reduzéiere kënnen, sollten Donor T-Zellen, déi mënschlecht Leukocyte-Antigen (HLA) Klass I an T-Zellrezeptor (TCR) expriméieren, ewechgeholl ginn, fir Graft-versus-Host-Anomalien ze vermeiden (Ren et al., 2017, 2017a). Mat CRISPR/Cas9 kann HDR gläichzäiteg TCR an HLA eliminéieren an de Gen ausschalten, deen de CAR kodéiert. Studien hunn gewisen, datt CRISPR/Cas9 benotzt ka ginn, fir Anti-CD19 CARs an den TCR-Locus anzeféieren, wouduerch CARs effizient produzéiert ginn, ouni T-Zellen ofzebauen (Dimitri et al., 2022). Multiplex-Technologien goufen entwéckelt, fir allogen CAR-T-Zellen ze generéieren, andeems TCR, Beta-2-Mikroglobulin (B2M), HLA-I-Ënnereenheet an aner Proteinen wéi PD-1 an CTLA-4 gläichzäiteg eliminéiert ginn, déi eventuell besser antikriibs Eegeschafte géint TNBC hunn (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
D'Benotzung vu CRISPR/Cas9 kéint d'Effektivitéit vu CAR-T-Zellen verbesseren. Adenosin ass bekannt fir immunsuppressiv Eegeschaften ze hunn a kann d'Antikriibsimmunitéit reduzéieren andeems et d'T-Zellfunktioun blockéiert an Adenosin-A2A-Rezeptoren (A2AR) aktivéiert (Vigano et al., 2019). D'Ausschalten vun A2AR mat CRISPR/Cas9 huet d'Effizienz vu CAR-T-Zellen in vivo däitlech verbessert (Giuffrida et al., 2021). Et ass bekannt datt T-Zellen verschidde phenotypesch Charakteristiken opweisen, wéi z. B. Zellexpansioun, Differenzéierung, oxidativen Stress a genomesche Stress. CRISPR/Cas9-baséiert T-Zell-Screening huet d'Stéierung vun 25 verschiddenen T-Zell-Rezeptor-Kinasen opgedeckt. Dorënner gouf gewisen datt d'Deletioun vun der p38-Kinase d'Antitumoraktivitéit vun T-Zellen verbessert, wat drop hiweist datt d'p38-Kinase e Schlësselregulator vun der CAR-T-Zellreguléierung ass (Gurusamy et al., 2020).
T-Zellen kënne mat CRISPR/Cas9 genetesch modifizéiert ginn, fir héich expriméiert TCRs ze produzéieren. Den Transfer vu genetesch modifizéierten T-Zellen op Patienten huet eng méi staark Antikriibsaktivitéit gewisen wéi endogen T-Zellen. Dofir kënnen endogen TCRs mat genetesch verännerten TCRs bei Patienten konkurréieren, wat de Potenzial vun der Kriibsimmuntherapie beaflosse kann. Fir dëst Problem ze léisen, kann d'Benotzung vu CRISPR/Cas9, fir endogen TCR-β an den Empfängerzellen ze entfernen an duerno TCR-β T-Zellen op Kriibspatienten ze transferéieren, besser Antikriibs-Immunantworten opweisen, ouni datt endogen sexuell Konkurrenz vun TCRs néideg ass (Fan et al. 2018). Dofir sinn TCRs, mat Ausnam vu CRISPR-modifizéierten T-Zellen, dausendfach méi empfindlech fir Tumorantigenen wéi normal TCR-transduzéiert T-Zellen. Zousätzlech weisen a verschiddene Leukämien verännert T-Zellen, déi duerch γδ TCR+ CRISPR generéiert ginn, eng méi héich Expressioun vun CD4+ an CD8+ T-Zellen wéi e Standard-TCR-Transfer (Legut et al., 2018). Dofir kéinten modifizéiert T-Zellen, déi duerch CRISPR/Cas9 generéiert ginn, eng effektiv Immuntherapie-Method sinn, fir TNBC ze bekämpfen.
Integrine sinn Zellhaftungsmoleküle, déi a zelluläre Transmembranen präsent sinn a fir d'Bindung vun Zellen un déi extrazellulär Matrix (ECM) suergen (Hamidi an Ivaska, 2018). Eng Dysreguléierung vun Integrine gëtt mat der Entwécklung a Migratioun vu Kriibs a Verbindung bruecht, andeems d'extrazellulär Matrix verännert gëtt, wat zu engem Iwwerliewe vu Kriibszellen am Blutt féiert (Hamidi an Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-vermittelten Integrin-Knockdown verlangsamt d'Tumorprogressioun, d'Metastaséierung an d'Kolonisatioun bei TNBC. Et gouf bericht, datt den Knockdown vun Integrin a5 (ITGA5) d'Zellmigratioun a Progressioun bei anere Kriibsarten, wéi z. B. Lungenkriibs, reduzéiert (Ju et al., 2017), wat drop hiweist, datt Integrin a5 och e Schlësselfaktor an der Pathogenese vun TNBC kéint sinn.
D'Generéiere vu Knockout-Mais mat traditionellen embryonalen Stammzellmethoden (ES-Methoden) ass e schafftintensiven, zäitopwännegen an ineffizienten Prozess. Et dauert Méint a Joeren, fir ES-Zellen duerch homolog Rekombinatioun unzespriechen, chimäresch Mais ze ziichten an se dann mat heterozygote Mais ze kräizen, fir homozygot Nokommen ze produzéieren. Komplex Kräizungen sinn néideg, fir Mais mat multiple genetesche Mutatiounen ze kreéieren. Vill Problemer sinn awer entstanen, wann Mais benotzt ginn, déi duerch Ablatioun vun ES-Zellen mat CRISPR/Cas9 oder duerch Mikroinjektioun vu CRISPR/Cas9-Komponenten an eenzelzelleg befruchtet Eeër generéiert goufen. Zum Beispill geschitt d'Aféierung vu Verännerungen dacks op biallelesche Loci an ass net genspezifesch. Et gouf viru kuerzem bericht, datt ES-Zellen, déi CRISPR/Cas9-Technologie benotzen, gläichzäiteg biallelesch Mutatiounen an bis zu 5 Genen aféieren kënnen (Nishizono et al., 2021). Fir dësen Zweck goufen Cas9 mRNA a fënnef genspezifesch gRNAs gläichzäiteg an ES-Zellen transfizéiert. Dëst ënnersträicht d'Verspriechen an d'Effektivitéit vun dëser Prozedur, obwuel dës Mutatioune méiglecherweis weiderginn gi sinn, wéi Grënnerlinne geziicht goufen, fir fënneffach Knockout-Mais ze produzéieren. D'Studie bericht och iwwer eng iwwerraschend Entdeckung: ES-Zellen sinn net méi néideg fir genetesch modifizéiert Mais ze kreéieren. Amplaz goufen Cas9 mRNA a gRNA an Embryonen am Eenzelzellstadium injizéiert, fir spezifesch Genprodukter ze entfernen. Als Resultat goufen Knockout-Grënnerlinne geschaf, déi theoretesch benotzt kënne ginn, fir d'Konsequenze vun der Gendeletioun bei Mais ze studéieren (Qin et al., 2016). Sou erlaabt CRISPR/Cas9 d'Schafung vun transgenen Mais fir TNBC zu méi niddrege Käschten ze behandelen wéi traditionell Gentechnik. Mat dem CRISPR/Cas-System gouf en neit Knockout-Mausmodell entwéckelt, dat erfollegräich Punktmutatiounen an engem oder méi endogene Genen an TNBC aféiere kann. Baséierend op dësem Konzept kënnen Déiermodeller vun TNBC och mat CRISPR/Cas9-vermittelter Deletioun vu BRCA1 a p53 entwéckelt ginn, wat zu Verloscht vun HR-Reparatur, genomescher Instabilitéit a mutante Phenotypen féiert (Annunziato et al., 2020).
Aktuell gi verschidde Methoden, wéi Mammographie, Magnéitresonanztomographie (MRT) an Ultraschall, benotzt fir TNBC ze diagnostizéieren. Dës Methoden hunn awer e puer Aschränkungen. Mammographie gëtt benotzt fir lokalt Broschtgewebe ze diagnostizéieren anstatt Metastasen, wou Kriibszellen an aner Organer migréiert sinn. Ultraschall ass keng zouverlässeg Method fir TNBC ze diagnostizéieren (Chen a Lee-Felker, 2023). MRT huet eng méi héich Empfindlechkeet wéi Ultraschall a Mammographie, awer hir diagnostesch Genauegkeet ass limitéiert (Sha a Chen, 2022). Tissuebiopsie ass eng invasiv Method fir Kriibszellen z'identifizéieren. A verschiddene Fäll kann eng Biopsie awer Kriibsgewebe iwwersinn, wann d'Nool vum interesséierte Beräich ewechgeet. Zousätzlech ass et ganz deier a kann fir de Patient traumatesch sinn. TNBC ass eng heterogen Aart vu Kriibs, sou datt eng Biopsie net genuch Informatiounen iwwer d'Aart vum Kriibs liwwert. Dofir ass eng nei diagnostesch zouverlässeg Method fir TNBC z'entdecken dringend gebraucht. CRISPR/Cas9 kéint als héichsensibel a minimalinvasiv Alternativ fir d'Diagnos vu Broschtkriibs déngen. Zu dësem Zweck kënnen CRISPR/Cas9-baséiert Strategien benotzt ginn, fir PCR-Methoden fir d'Diagnos vun TNBC ze verbesseren. Als éischt ginn d'Cas9- a cpf1-Proteine vum CRISPR-System benotzt, fir net-spezifesch DNA ze entfernen, an dann kënnen dës zwee Proteinen (Cas9 a cpf1) d'PAM-Sequenz erkennen, ier se un d'Zil-DNA binden (Deepak Singh et al., 2021). Sou kann PCR Mutatiounen identifizéieren, déi mat der Kriibsentwécklung verbonne sinn. Verschidde Studien hunn dës CRISPR-baséiert Strategie ugeholl, fir verschidde Mutatiounen a verschiddene Kriibsarten z'entdecken (Safari et al., 2019). Sou kënnen CRISPR-baséiert PCR-Methoden d'Ofhängegkeet vun der TNBC-Diagnos vun invasiven Methoden, wéi z. B. Biopsie-baséiert Immunhistochemie, reduzéieren.
Genotypesch Verännerungen an der Hormonrezeptorreguléierung goufen och bei TNBC demonstréiert (Chen a Russo, 2009). CRISPR/Cas9-baséiert PCR-Strategien, déi Mikroarrays fir d'Diagnos vun der Patientepositioun benotzen, kënnen dës Mutatiounen effektiv iwwerwaachen (Hajian et al., 2019). Et kéint de Gesondheetsversuerger och relevant Informatiounen iwwer spezifesch Mutatiounen bei TNBC-Patienten ubidden, wat hëllefe kéint, hire Behandlungsverlaf ze verbesseren. Dës kombinéiert Technik huet awer Grenzen. Dofir sinn extensiv Fuerschungsufwendungen erfuerderlech, ier dës CRISPR/Cas-PCR-Method am Gesondheetswiesen fir d'Diagnos vun TNBC ka benotzt ginn (Yang et al., 2019).
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 14. Oktober 2024