Differentialdiagnostik vu Lungenknäppchen, déi duerch Computertomographie (CT) identifizéiert ginn, bleift eng Erausfuerderung an der klinescher Praxis.Hei charakteriséieren mir de globalen Metabolom vu 480 Serum Echantillon, dorënner gesond Kontrollen, benign Lungenknäppchen, an Etapp I Lungen Adenocarcinom.Adenocarcinomen weisen eenzegaarteg metabolomesch Profiler, wärend benign Knollen a gesond Individuen héich Ähnlechkeet an metabolomesche Profiler hunn.An der Entdeckungsgrupp (n = 306), gouf e Set vu 27 Metaboliten identifizéiert fir tëscht benign a bösartigen Knollen z'ënnerscheeden.D'AUC vun der diskriminant Modell an der intern Validatioun (n = 104) an extern Validatioun (n = 111) Gruppen war 0,915 an 0,945, respektiv.Pathway Analyse huet erhéicht glycolytesch Metaboliten opgedeckt, verbonne mat verréngert Tryptophan am Lungen Adenocarcinom Serum am Verglach mat benigne Knollen a gesonde Kontrollen, a proposéiert datt Tryptophan Opname Glykolyse an Lungenkrebszellen fördert.Eis Etude beliicht de Wäert vu Serum Metabolit Biomarker bei der Bewäertung vum Risiko vu Lungenknäppchen, déi duerch CT festgestallt ginn.
Fréi Diagnos ass kritesch fir d'Iwwerliewensraten fir Kriibspatienten ze verbesseren.D'Resultater vum US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) an der Europäescher NELSON Studie hu gewisen datt Screening mat Low-Dosis Computertomographie (LDCT) d'Lungenkrebs Mortalitéit an héich-Risikogruppen wesentlech reduzéiere kann1,2,3.Zënter der verbreeter Benotzung vun LDCT fir Lungenkrebs-Screening, ass d'Heefegkeet vun zoufälleg radiographesche Befunde vun asymptomatesche Lungenknäppchen weider 4 eropgaang.Pulmonal Knuet ginn als Brennopazitéiten bis zu 3 cm Duerchmiesser 5 definéiert.Mir stellen Schwieregkeeten fir d'Wahrscheinlechkeet vun der Malignitéit ze beurteelen an ze këmmeren mat der grousser Unzuel vu pulmonaler Knollen, déi iwwregens op LDCT festgestallt goufen.Aschränkungen vum CT kënnen zu heefeg Suivi-Untersuchungen a falsch-positiv Resultater féieren, wat zu onnéideger Interventioun an Iwwerbehandlung féiert6.Dofir gëtt et e Besoin fir zouverlässeg an nëtzlech Biomarker z'entwéckelen fir Lungenkrebs an de fréie Stadien korrekt z'identifizéieren an déi meescht benign Knollen bei der initialer Detektioun 7 z'ënnerscheeden.
Iwwergräifend molekulare Analyse vu Blutt (Serum, Plasma, periphere Blutt mononuklear Zellen), inklusiv Genomik, Proteomik oder DNA Methylatioun8,9,10, huet zu engem wuessenden Interessi un der Entdeckung vun diagnostesche Biomarker fir Lungenkrebs gefouert.Mëttlerweil, Metabolomik Approche moossen cellulär Endprodukter déi beaflosst ginn vun endogenen an exogenen Handlungen an dofir applizéiert ginn fir d'Begrëff an d'Resultat vun der Krankheet virauszesoen.Liquid Chromatography-Tandem Mass Spektrometrie (LC-MS) ass eng wäit benotzt Method fir Metabolomikstudien wéinst senger héijer Empfindlechkeet a grousser dynamescher Palette, déi Metaboliten mat verschiddene physikaleschchemeschen Eegeschaften11,12,13 ofdecken.Och wann d'global metabolomesch Analyse vu Plasma / Serum benotzt gouf fir Biomarker ze identifizéieren, déi mat der Lungenkrebsdiagnos14,15,16,17 a Behandlungseffizienz verbonne sinn, 18 Serum Metabolit Klassifizéierer fir z'ënnerscheeden tëscht benigne a bösartigen Lungenknäppchen bleiwen nach vill studéiert.-massiv Fuerschung.
Adenokarzinom a Plateauzellkarzinom sinn déi zwee Haaptsubtypen vun net-klengzellen Lungenkrebs (NSCLC).Verschidde CT Screening Tester weisen datt Adenokarzinom déi heefegst histologesch Aart vu Lungenkrebs1,19,20,21 ass.An dëser Etude hu mir ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spektrometrie (UPLC-HRMS) benotzt fir metabolomics Analyse op insgesamt 695 Serum Echantillon auszeféieren, dorënner gesond Kontrollen, benign pulmonal Nodule, an CT-detektéiert ≤3 cm.Screening fir Stage I Lung Adenocarcinom.Mir hunn e Panel vu Serummetaboliten identifizéiert, déi Lungenadenokarcinom vu benign Knollen a gesonde Kontrollen ënnerscheeden.Pathway Beräicherung Analyse huet opgedeckt datt anormal Tryptophan a Glukosemetabolismus allgemeng Verännerungen am Lunge Adenocarcinom sinn am Verglach mat benigne Knollen a gesonde Kontrollen.Schlussendlech hu mir e serum metabolesche Klassifizéierer mat héijer Spezifizitéit a Sensibilitéit etabléiert a validéiert fir tëscht bösartigen a benigne pulmonaler Knollen z'ënnerscheeden, déi vum LDCT festgestallt goufen, wat an der fréicher Differentialdiagnos a Risikobewäertung hëllefe kann.
An der aktueller Etude, Geschlecht- an Alter-matched Serum Echantillon goufen retrospektiv gesammelt aus 174 gesond Kontrollen, 292 Patienten mat benign pulmonal Nodules, an 229 Patienten mat Etapp I Lung adenocarcinoma.Demographesch Charakteristike vun de 695 Themen ginn an der Ergänzungstabell 1 gewisen.
Wéi an Dorënner 1a gewisen, goufen am Ganzen 480 serum Echantillon, dorënner 174 gesond Kontroll (HC), 170 benign nodules (BN), an 136 Etapp ech haett adenocarcinoma (LA) Echantillon, um Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt.Entdeckungskohort fir ongeziilt metabolomesch Profiléierung mat Hëllef vu Ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spektrometrie (UPLC-HRMS).Wéi an der Ergänzungsbild 1 gewisen, goufen differentiell Metaboliten tëscht LA an HC, LA a BN identifizéiert fir e Klassifizéierungsmodell z'etabléieren an d'Differentialweeër Analyse weider ze entdecken.104 Echantillon gesammelt vum Sun Yat-sen University Cancer Center an 111 Echantillon vun zwee anere Spideeler gesammelt goufen intern an extern Validatioun ënnerworf, respektiv.
eng Studiebevëlkerung an der Entdeckungskohort déi eng global Serummetabolomik Analyse gemaach huet mat Hëllef vu Ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS).b Partiell klengste Quadrat diskriminant Analyse (PLS-DA) vum Gesamtmetabolom vu 480 Serum Echantillon aus der Studiekohort, dorënner gesond Kontrollen (HC, n = 174), benign Knollen (BN, n = 170), an Etapp I Lungen Adenocarcinom (Los Angeles, n = 136).+ESI, positiv electrospray ionization Modus, -ESI, negativ electrospray ionization Modus.c–e Metaboliten mat wesentlech ënnerschiddlechen Heefegkeeten an zwou gegebene Gruppen (zwee-tailed Wilcoxon ënnerschriwwen Ranktest, falsch Entdeckungsrate ugepasst p Wäert, FDR <0.05) ginn a rout (Faltverännerung> 1.2) a blo (Klappännerung <0.83) gewisen. .) op der Vulkan Grafik gewisen.f Hierarchesch Clustering Hëtzt Kaart déi bedeitend Differenzen an der Unzuel vun annotéierten Metaboliten tëscht LA a BN weist.Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
D'total serum metabolome vun 174 HC, 170 BN an 136 LA an der Entdeckung Grupp war mat UPLC-HRMS Analyse analyséiert.Mir weisen éischt datt Qualitéitskontroll (QC) Echantillon enk am Zentrum vun engem unsupervised Haaptkomponent Analyse (PCA) Modell Stärekoup, confirméiert der Stabilitéit vun der aktueller Etude Leeschtung (Ergänzungsbild 2).
Wéi an der partiell klengste Quadratdiskriminant Analyse (PLS-DA) an der Figur 1 b gewisen, hu mir festgestallt datt et kloer Differenzen tëscht LA a BN, LA an HC a positiven (+ ESI) an negativen (-ESI) Elektrospray Ioniséierungsmodi waren. .isoléiert.Allerdéngs goufen keng grouss Differenzen tëscht BN an HC zu + ESI an -ESI Konditiounen fonnt.
Mir hunn 382 differentiell Fonctiounen tëscht LA an HC, 231 differentiell Fonctiounen tëscht LA an BN, an 95 differentiell Fonctiounen tëscht BN an HC (Wilcoxon ënnerschriwwen Rank Test, FDR <0,05 a multiple Ännerung> 1,2 oder <0,83) (Figure .1c-e) fonnt. )..Peaks goufen weider annotéiert (Ergänzungsdaten 3) géint eng Datebank (mzCloud / HMDB / Chemspider Bibliothéik) duerch m / z Wäert, Retention Zäit a Fragmentatioun Mass Spektrum Sich (Detailer beschriwwen an Methoden Rubrik) 22.Schlussendlech goufen 33 an 38 annotéiert Metaboliten mat wesentlechen Differenzen am Heefegkeet fir LA versus BN (Dorënner 1f an Ergänzungstabell 2) an LA versus HC (Ergänzungsbild 3 an Ergänzungstabell 2) identifizéiert.Am Géigesaz, goufen nëmmen 3 Metaboliten mat wesentlechen Ënnerscheeder am Heefegkeet am BN an HC identifizéiert (Ergänzungstabell 2), konsequent mat der Iwwerlappung tëscht BN an HC am PLS-DA.Dës differentiell Metaboliten decken eng breet Palette vu Biochemikalien (Ergänzungsbild 4).Zesummegefaasst weisen dës Resultater bedeitend Verännerungen am Serummetabolom, déi béiswëlleg Transformatioun vu fréie Stadium Lungenkrebs reflektéieren am Verglach mat benigne Lungenknollen oder gesonde Sujeten.Mëttlerweil suggeréiert d'Ähnlechkeet vum Serummetabolom vu BN an HC datt benign pulmonal Knollen vill biologesch Charakteristiken mat gesonden Individuen deelen.Virausgesat datt Epidermal Wuesstumsfaktor Rezeptor (EGFR) Genmutatiounen am Lungen Adenocarcinom Subtyp 23 heefeg sinn, hu mir probéiert den Impakt vun de Chauffermutatiounen op de Serummetabolom ze bestëmmen.Mir analyséiert dann de globale metabolomic Profil vun 72 Fäll mat EGFR Status an der haett adenocarcinoma Grupp.Interessanterweis hu mir vergläichbar Profiler tëscht EGFR mutant Patienten (n = 41) an EGFR Wild-Typ Patienten (n = 31) an der PCA Analyse (Ergänzungsbild 5a) fonnt.Wéi och ëmmer, identifizéiert mir 7 Metaboliten deenen hir Heefegkeet wesentlech geännert gouf bei Patienten mat EGFR Mutatioun am Verglach zu Patienten mat Wild-Typ EGFR (t Test, p <0,05 a klappt Ännerung> 1,2 oder <0,83) (Ergänzungsbild 5b).D'Majoritéit vun dëse Metaboliten (5 vu 7) sinn Acylcarnitine, déi eng wichteg Roll bei Fettsäureoxidatiounsweeër spillen.
Wéi illustréiert am Workflow an der Figur 2 a gewisen, goufen d'Biomarker fir d'Nodule Klassifikatioun kritt mat mannst absolute Schrumpfungsbedreiwer a Selektioun baséiert op 33 Differentialmetaboliten identifizéiert an LA (n = 136) a BN (n = 170).Bescht Kombinatioun vu Variabelen (LASSO) - binäre logistesche Regressiounsmodell.Zéngfach Kräizvalidatioun gouf benotzt fir d'Zouverlässegkeet vum Modell ze testen.Variabel Auswiel a Parameterreguléierung ginn ugepasst duerch eng Wahrscheinlechkeet Maximaliséierungsstrof mam Parameter λ24.Global metabolomics Analyse war weider onofhängeg an der intern Validatioun (n = 104) an extern Validatioun (n = 111) Gruppen gesuergt der Klassifikatioun Leeschtung vun der discriminant Modell ze Test.Als Resultat, goufen 27 metabolites an der Entdeckung Formatioun als déi bescht discriminant Modell mat de gréisste Moyenne AUC Wäert (Lalumi 2b) identifizéiert, dorënner 9 fräi Aktivitéit an 18 ofgeholl Aktivitéit zu LA Verglach zu BN (Lalumi 2c).
Workflow fir e Pulmonal Nodule Klassifizéierer ze bauen, dorënner d'Auswiel vun de beschte Panel vu Serum Metaboliten am Entdeckungsset mat engem binäre logistesche Regressiounsmodell iwwer zéngfach Kräizvalidatioun an d'Evaluatioun vun der prévisiver Leeschtung an internen an externen Validatiounssets.b Cross-Validatiounsstatistike vum LASSO Regressiounsmodell fir metabolesch Biomarker Selektioun.D'Zuelen uewen uginn representéieren d'Duerchschnëttszuel vu Biomarker, déi op enger bestëmmter λ ausgewielt goufen.Déi rout Punktelinn representéiert den duerchschnëttleche AUC Wäert op der entspriechender Lambda.Grey Feeler Baren representéieren de Minimum a maximal AUC Wäerter.Déi gestippte Linn weist de beschte Modell mat den 27 ausgewielte Biomarker un.AUC, Beräich ënner der Receiver Operatioun Charakteristik (ROC) Curve.c Fold Ännerungen vun 27 ausgewielte Metaboliten an der LA Grupp am Verglach mat der BN Grupp an der Entdeckungsgrupp.Red Kolonn - Aktivatioun.Déi blo Kolonn ass e Réckgang.d-f Receiver Operatioun Charakteristik (ROC) Kéiren déi d'Kraaft vum diskriminante Modell weisen op Basis vu 27 Metabolit Kombinatiounen an der Entdeckung, internen an externen Validatiounssets.Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
E Prognosemodell gouf erstallt baséiert op de gewiichtte Regressiounskoeffizienten vun dësen 27 Metaboliten (Ergänzungstabell 3).ROC Analyse baséiert op dës 27 metabolites nozeginn engem Beräich ënnert der Kéier (AUC) Wäert vun 0,933, Entdeckung Grupp Empfindlechkeet war 0,868, a Spezifizitéit war 0,859 (Lalumi 2d).Mëttlerweil, ënner den 38 annotéierten Differentialmetaboliten tëscht LA an HC, huet eng Rei vu 16 Metaboliten en AUC vun 0,902 erreecht mat enger Sensibilitéit vun 0,801 a Spezifizitéit vun 0,856 bei der Diskriminatioun vun LA aus HC (Ergänzungsbild 6a-c).AUC Wäerter baséiert op verschiddene falt Ännerungsschwellen fir differentiell Metaboliten goufen och verglach.Mir hunn erausfonnt datt de Klassifikatiounsmodell am Beschten an der Diskriminatioun tëscht LA a BN (HC) gesuergt huet wann de Faltännerungsniveau op 1,2 versus 1,5 oder 2,0 gesat gouf (Ergänzungsbild 7a,b).De Klassifikatiounsmodell, baséiert op 27 Metabolitgruppen, gouf weider an internen an externe Kohorten validéiert.D'AUC war 0.915 (Sensibilitéit 0.867, Spezifizitéit 0.811) fir intern Validatioun an 0.945 (Sensibilitéit 0.810, Spezifizitéit 0.979) fir extern Validatioun (Figebam. 2e, f).Ze bewäerten interlaboratory Effizienz, 40 Echantillon vun der externen Kohort sech an engem externen Labo analyséiert wéi an der Method Rubrik beschriwwen.D'Klassifikatioun Genauegkeet erreecht eng AUC vun 0,925 (Ergänzlech Figur 8).Well d'Lunge squamous Zell carcinoma (LUSC) den zweet heefegste Subtyp vun net-kleng Zell Lungenkrebs (NSCLC) nom Lungen Adenocarcinom (LUAD) ass, hu mir och déi validéiert potenziell Utilitéit vu metabolesche Profiler getest.BN an 16 Fäll vun LUSC.D'AUC vun der Diskriminatioun tëscht LUSC a BN war 0.776 (Ergänzungsbild 9), wat méi schlecht Fäegkeet besot am Verglach mat Diskriminatioun tëscht LUAD a BN.
Studien hu gewisen datt d'Gréisst vun de Knollen op CT-Biller positiv mat der Wahrscheinlechkeet vu Malignitéit korreléiert ass a bleift e wesentlechen Determinant vun der Knuetbehandlung25,26,27.Analyse vun Daten aus der grousser Kohort vun der NELSON-Screening-Studie huet gewisen datt de Risiko vu Malignitéit bei Themen mat Knäpper <5 mm souguer ähnlech wéi bei Themen ouni Knäpper 28 war.Dofir ass d'Mindestgréisst, déi regelméisseg CT-Iwwerwaachung erfuerdert, 5 mm, wéi recommandéiert vun der British Thoracic Society (BTS), a 6 mm, wéi recommandéiert vun der Fleischner Society 29.Wéi och ëmmer, Knollen méi grouss wéi 6 mm an ouni evident benign Features, genannt onbestëmmten Lungenknäppchen (IPN), bleiwen eng grouss Erausfuerderung bei der Evaluatioun an der Gestioun an der klinescher Praxis30,31.Mir hunn als nächst iwwerpréift ob Knuetgréisst metabolomesch Ënnerschrëfte beaflosst mat gepoolte Proben aus der Entdeckung an der interner Validatiounskohorten.Fokusséiert op 27 validéiert Biomarker, hu mir als éischt d'PCA Profiler vun HC a BN sub-6 mm Metabolome verglach.Mir hunn erausfonnt datt déi meescht vun den Datenpunkte fir HC a BN iwwerlappt hunn, wat beweist datt d'Serummetabolitniveauen a béide Gruppen ähnlech waren (Figebam. 3a).D'Fonktioun Kaarten ganze verschiddene Gréisst Beräicher bliwwen an BN an LA (Lalumi 3b, c), iwwerdeems eng Trennung tëscht malignant an benign nodules am 6-20 mm Gamme observéiert gouf (Lalumi 3d).Dës Kohort hat eng AUC vun 0,927, Spezifizitéit vun 0,868, a Sensibilitéit vun 0,820 fir d'Malignitéit vun Knollen, déi 6 bis 20 mm moossen (Figebam. 3e, f).Eis Resultater weisen datt de Klassifizéierer metabolesch Verännerungen erfaasst, déi duerch fréi bösart Transformatioun verursaacht ginn, onofhängeg vun der Nodulegréisst.
ad Verglach vu PCA Profiler tëscht spezifizéierte Gruppen baséiert op engem metabolesche Klassifizéierer vu 27 Metaboliten.CC an BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.an LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm an LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e Receiver Betribssystemer Charakteristik (ROC) Curve weist diskriminant Modell Leeschtung fir nodules 6-20 mm.f Wahrscheinlechkeetswäerter goufen berechent op Basis vum logistesche Regressiounsmodell fir Knollen déi 6-20 mm moossen.Déi gro Punktelinn representéiert den optimalen Ofschnëttswäert (0,455).D'Zuelen hei uewen representéieren de Prozentsaz vu Fäll, déi fir Los Angeles virgesi sinn.Benotzt en zwee-tailed Student's t Test.PCA, Haaptkomponentanalyse.AUC Beräich ënner der Kurve.Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
Véier Echantillon (am Alter 44-61 Joer) mat ähnlechen pulmonal Nodule Gréissten (7-9 mm) sech weider ausgewielt d'Leeschtung vun der proposéiert malignancy Prévisiounsmodell ze illustréieren (Figebam. 4a, b).Beim initialen Duerchmusterung huet de Fall 1 als zolitte Knuet mat Kalkifizéierung presentéiert, eng Feature verbonne mat Benignitéit, wärend de Fall 2 als onbestëmmten deelweis zolitte Knuet ouni offensichtlech benign Feature presentéiert gouf.Dräi Ronnen vun Suivi CT scannt gewisen, datt dës Fäll stabil iwwer e 4-Joer Period bliwwen a goufen dofir benign nodules considéréiert (Figebam. 4a).Am Verglach mat der klinescher Evaluatioun vu seriellen CT-Scans, huet d'Single-Shot-Serummetabolitanalyse mam aktuellen Klassifizéierungsmodell séier a korrekt dës benign Knollen identifizéiert op Basis vu probabilistesche Contrainten (Table 1).Figur 4b am Fall 3 weist e Knuet mat Unzeeche vu Pleural Réckzuch, wat am meeschten mat Malignitéit32 assoziéiert ass.Fall 4 presentéiert als onbestëmmten deelweis zolidd Knuet ouni Beweiser fir eng benign Ursaach.All dës Fäll goufen als malignant no der classifier Modell virausgesot (Table 1).D'Bewäertung vun Otemschwieregkeeten adenocarcinoma war vun histopathological Ënnersichung no Otemschwieregkeeten resection Agrëff (Lalumi 4b) bewisen.Fir den externen Validatiounsset huet de metabolesche Klassifizéierer zwee Fäll vun onbestëmmten Lungenknäppchen méi grouss wéi 6 mm virausgesot (Ergänzungsbild 10).
CT-Biller vun der axialer Fënster vun de Lunge vun zwee Fäll vu benigne Knollen.Am Fall 1 huet de CT-Scan no 4 Joer e stabile festen Nodul vun 7 mm mat Kalkifizéierung an der rietser ënneschter Lobe gewisen.Am Fall 2 huet de CT-Scan no 5 Joer e stabilen, deelweis zolitte Knuet mat engem Duerchmiesser vu 7 mm an der rietser ieweschter Lobe opgedeckt.b Axial Fënster CT Biller vun de Longen an entspriechend pathologesch Studien vun zwee Fäll vun Etapp ech adenocarcinoma virun Lunge resection.Fall 3 huet e Knuet mat engem Duerchmiesser vun 8 mm an der rietser ieweschter Lobe mat pleural Réckzuch opgedeckt.Fall 4 huet en deelweis zolitte Buedem-Glas Nodule opgedeckt, deen 9 mm an der lénker ieweschter Lobe moosst.Hematoxylin an Eosin (H & E) staining vun resected Otemschwieregkeeten Otemschwieregkeeten (Skala Bar = 50 μm) beweist der acinar Wuesstem Muster vun haett adenocarcinoma.Pfeile weisen datt Knollen op CT-Biller festgestallt goufen.H&E Biller sinn representativ Biller vu multiple (> 3) mikroskopesche Felder, déi vum Pathologe gepréift ginn.
Zesummegefaasst weisen eis Resultater de potenzielle Wäert vu Serum Metabolit Biomarker an der Differentialdiagnos vu pulmonaler Knollen, déi Erausfuerderunge stellen wann Dir CT Screening evaluéiert.
Baséierend op engem validéierte Differentialmetabolitpanel hu mir versicht biologesch Korrelate vu grousse metabolesche Verännerungen z'identifizéieren.KEGG Passerelle Beräicherung Analyse vun MetaboAnalyst identifizéiert 6 gemeinsam bedeitendst verännert Weeër tëscht den zwou bestëmmte Gruppen (LA vs. HC an LA vs. BN, ugepasst p ≤ 0,001, Effekt> 0,01).Dës Verännerungen waren duerch Stéierungen am Pyruvat-Metabolismus, Tryptophan-Metabolismus, Niacin- an Nikotinamid-Metabolismus, Glykolyse, den TCA-Zyklus a Purin-Metabolismus charakteriséiert (Fig. 5a).Mir hunn dunn weider geziilte Metabolomik gemaach fir grouss Ännerungen mat absoluter Quantifizéierung z'iwwerpréiwen.Bestëmmung vu gemeinsame Metaboliten an allgemeng verännerte Weeër duerch Triple Quadrupole Mass Spektrometrie (QQQ) mat authentesche Metabolitstandards.Demographesch Charakteristiken vun der Metabolomics Etude Zil Prouf sinn an Zousaz Table abegraff 4. Konsequent mat eise globale metabolomics Resultater, quantitativ Analyse bestätegt, datt hypoxanthine an xanthine, pyruvate, an lactate am LA vergréissert goufen am Verglach zu BN an HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Wéi och ëmmer, keng bedeitend Differenzen an dëse Metaboliten goufen tëscht BN an HC fonnt.
KEGG Pathway Beräicherung Analyse vu wesentlech verschiddene Metaboliten an der LA Grupp am Verglach zu de BN an HC Gruppen.En zwee-tailed Globaltest gouf benotzt, a p Wäerter goufen mat der Holm-Bonferroni Method ugepasst (ugepasst p ≤ 0,001 an Effektgréisst> 0,01).b-d Violin Diagrammer weisen Hypoxanthin, Xanthin, Laktat, Pyruvat, an Tryptophan Niveauen am Serum HC, BN, a LA bestëmmt duerch LC-MS /MS (n = 70 pro Grupp).Wäiss a schwaarz Punktelinn weisen de Median a Quartil respektiv.e Violin Komplott weist normaliséiert Log2TPM (Transkriptiounen pro Millioun) mRNA Ausdrock vun SLC7A5 a QPRT am Lungen Adenocarcinom (n = 513) am Verglach zum normale Lungegewebe (n = 59) an der LUAD-TCGA Dataset.Déi wäiss Këscht representéiert d'interquartile Gamme, déi horizontal schwaarz Linn am Zentrum stellt de Median duer, an déi vertikal schwaarz Linn aus der Këscht stellt den 95% Vertrauensintervall (CI).f Pearson Korrelatioun Komplott vun SLC7A5 an GAPDH Ausdrock am Longen adenocarcinoma (n = 513) an normal Otemschwieregkeeten Otemschwieregkeeten (n = 59) am TCGA Dataset.De groe Beräich representéiert den 95% CI.r, Pearson Korrelatiounskoeffizient.g Normaliséiert Zellular Tryptophan Niveauen an A549 Zellen transfected mat nonspecific shRNA Kontroll (NC) an shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bestëmmt vun LC-MS /MS.Statistesch Analyse vu fënnef biologesch onofhängege Proben an all Grupp gëtt presentéiert.h Cellular Niveauen vun NADt (total NAD, inklusiv NAD+ an NADH) an A549 Zellen (NC) an SLC7A5 Knockdown A549 Zellen (Sh1, Sh2).Statistesch Analyse vun dräi biologesch onofhängeg Echantillon an all Grupp gëtt presentéiert.ech Glycolytic Aktivitéit vun A549 Zellen virun an no SLC7A5 knockdown war vun extracellular acidification Taux (ECAR) gemooss (n = 4 biologesch onofhängeg Echantillon pro Grupp).2-DG,2-Deoxy-D-Glukose.Zwee-tailed Student d't Test war an (b-h) benotzt.An (g-i), Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± SD, all Experiment gouf dräimol onofhängeg gemaach an d'Resultater waren ähnlech.Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
Bedenkt de wesentlechen Impakt vum verännerten Tryptophan Metabolismus an der LA Grupp, hu mir och Serum Tryptophan Niveauen an den HC, BN, a LA Gruppen mat QQQ bewäert.Mir hunn erausfonnt datt Serum Tryptophan am LA reduzéiert gouf am Verglach mam HC oder BN (p <0.001, Figure 5d), wat konsequent mat fréiere Befunde ass datt zirkuléierend Tryptophan Niveauen méi niddereg sinn bei Patienten mat Lungenkrebs wéi a gesonde Kontrollen aus der Kontrollgruppe33,34 ,35.Eng aner Etude mat PET / CT Tracer 11C-Methyl-L-Tryptophan huet festgestallt datt d'Tryptophan-Signal-Retentiounszäit am Lungenkrebsgewebe wesentlech erhéicht gouf am Verglach mat benigne Läsionen oder normalen Tissu36.Mir hypotheséieren datt d'Ofsenkung vum Tryptophan am LA Serum aktiv Tryptophan-Aufnahme vu Lungenkrebszellen reflektéiere kann.
Et ass och bekannt datt d'Ennprodukt vum kynurenine Wee vum Tryptophan Katabolismus NAD + 37,38 ass, wat e wichtege Substrat ass fir d'Reaktioun vu Glyceraldehyd-3-Phosphat mat 1,3-Bisphosphoglycerat an der Glykolyse39.Wärend fréier Studien op d'Roll vum Tryptophan Katabolismus an der Immunreguléierung konzentréiert hunn, hu mir probéiert d'Zesummespill tëscht Tryptophan Dysregulatioun a glycolytesche Weeër ze klären, déi an der aktueller Studie observéiert ginn.Solute Transporter Famill 7 Member 5 (SLC7A5) ass bekannt als Tryptophan Transporter43,44,45.Quinolinsäure-Phosphoribosyltransferase (QPRT) ass en Enzym, deen no ënnen vum Kynurenin-Wee läit, deen Quinolinsäure an NAMN46 konvertéiert.Inspektioun vun der LUAD TCGA Dataset verroden, datt souwuel SLC7A5 an QPRT am entholl Otemschwieregkeeten am Verglach zu normal Otemschwieregkeeten vill upregulated goufen (Lalumi 5e).Dës Erhéijung gouf an de Stadien I an II souwéi an de Stadien III a IV vum Lungenadenocarcinom (Ergänzungsbild 11) observéiert, wat fréi Stéierungen am Tryptophan-Metabolismus mat Tumorigenesis assoziéiert beweist.
Zousätzlech, huet d'LUAD-TCGA Dataset eng positiv Korrelatioun tëscht SLC7A5 an GAPDH mRNA Ausdrock zu Kriibs Patient Echantillon gewisen (r = 0,45, p = 1.55E-26, Dorënner 5f).Am Géigesaz, war keng bedeitend Korrelatioun tëscht esou Gentherapie Ënnerschrëften am normal Otemschwieregkeeten Otemschwieregkeeten fonnt (r = 0,25, p = 0,06, Dorënner 5f).Knockdown vun SLC7A5 (Ergänzungsbild 12) an A549 Zellen wesentlech reduzéiert cellulär Tryptophan an NAD (H) Niveauen (Figure 5g, h), wat zu attenuéierter glycolytescher Aktivitéit resultéiert wéi gemooss duerch extrazellulär Säurungsquote (ECAR) (Figur 1).5i).Also, baséiert op metabolesche Verännerungen am Serum an in vitro Detektioun, hypothese mir datt den Tryptophan Metabolismus NAD + duerch de kynurenine Wee produzéiere kann an eng wichteg Roll bei der Promotioun vun der Glykolyse am Lungenkrebs spillen.
Studien hu gewisen datt eng grouss Unzuel vun onbestëmmten Lungenknäppchen, déi vum LDCT festgestallt ginn, zum Besoin fir zousätzlech Tester wéi PET-CT, Lungebiopsie an Iwwerbehandlung duerch eng falsch-positiv Diagnos vu Malignitéit féieren kënnen.31 Wéi an der Figur 6 gewisen, Eis Etude identifizéiert e Panel vu Serummetaboliten mat potenziellen diagnostesche Wäert, deen d'Risikostratifikatioun an d'spéider Gestioun vu Pulmonalknäppchen, deen duerch CT entdeckt gëtt, verbesseren.
Pulmonal Knuet ginn evaluéiert mat Hëllef vu Low-Dosis Computertomographie (LDCT) mat Imaging Features, déi op benign oder bösart Ursaachen suggeréieren.Den onséchere Resultat vun Knollen kann zu heefege Follow-up Visiten, onnéideg Interventiounen an Iwwerbehandlung féieren.D'Inklusioun vu serum metabolesche Klassifizéierer mat diagnostesche Wäert kann d'Risikobeurteilung an d'spéider Gestioun vu pulmonaler Knollen verbesseren.PET Positron Emissioun Tomographie.
Date vun der US NLST Studie an der Europäescher NELSON Studie suggeréieren datt d'Screening vun héich-Risikogruppen mat Low-Dosis Computertomographie (LDCT) d'Lungenkrebs Mortalitéit reduzéieren1,3.Wéi och ëmmer, d'Risikobeurteilung an déi spéider klinesch Gestioun vu grousser Zuel vun zoufälleger Lungenknäppchen, déi duerch LDCT festgestallt ginn, bleiwen déi Erausfuerderung.D'Haaptziel ass d'korrekt Klassifikatioun vun existéierende LDCT-baséierte Protokoller ze optimiséieren andeems verlässlech Biomarker integréiert sinn.
Bestëmmte molekulare Biomarker, wéi Bluttmetaboliten, goufen identifizéiert andeems Lungenkrebs mat gesonde Kontrollen vergläicht15,17.An der aktueller Studie konzentréiere mir eis op d'Applikatioun vun der Serummetabolomik Analyse fir tëscht benign a bösartigen Lungenknäppchen z'ënnerscheeden, déi iwwregens duerch LDCT festgestallt goufen.Mir verglach de globale Serummetabolom vu gesonde Kontroll (HC), benign Lungenknäppchen (BN), a Stage I Lung Adenocarcinom (LA) Proben mat UPLC-HRMS Analyse.Mir hu fonnt datt HC a BN ähnlech metabolesch Profiler haten, wärend LA bedeitend Ännerungen am Verglach zum HC a BN gewisen huet.Mir identifizéiert zwee Sätz vu Serummetaboliten déi LA vun HC a BN ënnerscheeden.
Den aktuellen LDCT-baséierten Identifikatiounsschema fir benign a bösart Knuet baséiert haaptsächlech op der Gréisst, Dicht, Morphologie a Wuesstumsrate vun Knollen iwwer Zäit30.Virdrun Studien hu gewisen datt d'Gréisst vun de Knollen enk mat der Wahrscheinlechkeet vu Lungenkrebs verbonnen ass.Och bei héije Risikopatienten ass de Risiko vu Malignitéit an Noden <6 mm <1%.De Risiko vu Malignitéit fir Knollen, déi 6 bis 20 mm moossen, läit tëscht 8% an 64%30.Dofir recommandéiert d'Fleischner Society e Cutoff-Duerchmiesser vu 6 mm fir routinéiert CT-Suivi.29 Wéi och ëmmer, d'Risikobeurteilung an d'Gestioun vun onbestëmmten Lungenknäppchen (IPN) méi grouss wéi 6 mm sinn net adequat gemaach ginn 31.Déi aktuell Gestioun vu kongenitalen Häerzkrankheeten baséiert normalerweis op oppassend Waarden mat häufiger CT-Iwwerwaachung.
Baséierend op dem validéierte Metabolom hu mir fir d'éischte Kéier d'Iwwerlappung vu metabolomesche Signaturen tëscht gesonden Individuen a benigne Knollen <6 mm bewisen.Déi biologesch Ähnlechkeet ass konsequent mat fréiere CT Erkenntnisser datt de Risiko vu Malignitéit fir Knollen <6 mm sou niddereg ass wéi fir Themen ouni Nodes. Ähnlechkeet an metabolomesche Profiler, suggeréiert datt déi funktionell Definitioun vu benign Ätiologie konsequent ass onofhängeg vun der Nodulegréisst.Also, modern diagnostesch Serum Metabolit Paneele kënnen een eenzegen Assay als Regel-Out Test ubidden wann Knollen am Ufank op CT festgestallt ginn a potenziell d'Serien Iwwerwaachung reduzéieren.Zur selwechter Zäit huet déiselwecht Panel vu metabolesche Biomarker bösarteg Knollen ≥6 mm a Gréisst vu benign Knollen ënnerscheet a präzis Prognosen fir IPNs vun ähnlecher Gréisst an zweedeiteg morphologesch Features op CT Biller geliwwert.Dëse Serum Metabolismus Klassifizéierer huet gutt geschafft fir d'Malignitéit vu Knollen ≥6 mm mat engem AUC vun 0,927 virauszesoen.Zesummegefaasst, weisen eis Resultater datt eenzegaarteg serum metabolomesch Ënnerschrëfte spezifesch fréi Tumor-induzéiert metabolesch Verännerungen reflektéiere kënnen a potenzielle Wäert als Risikoprädiktoren hunn, onofhängeg vun der Nodulegréisst.
Notamment sinn Lungenadenokarzinom (LUAD) a Plateauzellkarzinom (LUSC) d'Haaptaarte vun net-klengzellen Lungenkrebs (NSCLC).Virausgesat datt LUSC staark mat Tubakverbrauch assoziéiert ass47 an LUAD ass déi heefegst Histologie vun iwwregens Lungenknäppchen, déi op CT Screening48 festgestallt goufen, gouf eise Klassifizéierungsmodell speziell fir Etapp I Adenokarcinom Echantillon gebaut.Wang a Kollegen hunn och op LUAD fokusséiert an néng Lipid Ënnerschrëften identifizéiert mat Lipidomik fir fréi Stuf Lungenkrebs vu gesonden Individuen z'ënnerscheeden17.Mir hunn den aktuellen Klassifizéierungsmodell op 16 Fäll vu Bühn I LUSC a 74 benign Knollen getest an eng niddereg LUSC Prediction Genauegkeet observéiert (AUC 0.776), suggeréiert datt LUAD an LUSC hir eege metabolomesch Ënnerschrëften hunn.Tatsächlech goufen LUAD an LUSC gewisen an der Etiologie, biologescher Hierkonft a genetescher Aberratioun ze ënnerscheeden49.Dofir sollten aner Aarte vun Histologie an Trainingsmodeller fir Bevëlkerungsbaséiert Detektioun vu Lungenkrebs an Duerchmusterungsprogrammer abegraff ginn.
Hei identifizéiert mir déi sechs am meeschte verännert Weeër am Longen Adenocarcinom am Verglach mat gesonde Kontrollen a benign Knollen.Xanthin an Hypoxanthin sinn allgemeng Metaboliten vum purin metabolesche Wee.Konsequent mat eise Resultater, Zwëscheprodukter, déi mam Purin-Metabolismus verbonne sinn, goufen wesentlech am Serum oder Stoffer vu Patienten mat Lungenadenocarcinom erhéicht am Verglach mat gesonde Kontrollen oder Patienten an der preinvasiver Stadium15,50.Erhéicht Serum Xanthin an Hypoxanthin Niveauen kënnen den Anabolismus reflektéieren, deen duerch séier proliferéierend Kriibszellen erfuerderlech ass.Dysreguléierung vum Glukosemetabolismus ass e bekannte Markenzeechen vum Kriibsmetabolismus51.Hei hu mir eng bedeitend Erhéijung vum Pyruvat a Laktat an der LA Grupp observéiert am Verglach mat der HC a BN Grupp, wat konsequent ass mat fréiere Berichter iwwer glycolytesche Wee Anomalien an de Serummetabolomprofile vun net-klengzellen Lungenkrebs (NSCLC) Patienten an gesond Kontrollen.d'Resultater sinn konsequent52,53.
Wichteg ass, datt mir eng invers Korrelatioun tëscht Pyruvat an Tryptophan Metabolismus am Serum vu Lungenadenocarcinome observéiert hunn.Serum Tryptophan Niveauen goufen an der LA Grupp reduzéiert am Verglach mat der HC oder BN Grupp.Interessanterweis huet eng fréier grouss Studie mat enger potenzieller Kohort festgestallt datt niddereg Niveaue vum zirkuléierende Tryptophan mat engem erhéicht Risiko vu Lungenkrebs 54 verbonne sinn.Tryptophan ass eng wesentlech Aminosäure déi mir ganz aus Iessen kréien.Mir schléissen datt Serum Tryptophan Ausschöpfung am Lungenadenocarcinom séier Ausarmung vun dësem Metabolit reflektéiere kann.Et ass bekannt datt d'Ennprodukt vum Tryptophan Katabolismus iwwer de kynurenine Wee d'Quell vun der de novo NAD + Synthese ass.Well NAD + haaptsächlech duerch de Rettungswee produzéiert gëtt, bleift d'Wichtegkeet vun NAD + am Tryptophan Metabolismus a Gesondheet a Krankheet ze bestëmmen46.Eis Analyse vun der TCGA Datebank huet gewisen, datt den Ausdrock vun der Tryptophan Transporter solute Transporter 7A5 (SLC7A5) am Lunge adenocarcinoma am Verglach mat normal Kontrollen bedeitend erhéicht gouf a war positiv mam Ausdrock vun der glycolytic Enzym GAPDH korreléiert.Virdrun Studien hu sech haaptsächlech op d'Roll vum Tryptophan Katabolismus an der Ënnerdréckung vun der Antitumor Immunreaktioun konzentréiert40,41,42.Hei beweise mir datt d'Inhibitioun vun der Tryptophan-Aufnahme duerch Knockdown vum SLC7A5 a Lungenkrebszellen zu enger spéiderer Ofsenkung vun de celluläre NAD-Niveauen an enger gläichzäiteg Dämpfung vun der glycolytescher Aktivitéit resultéiert.Zesummegefaasst liwwert eis Etude eng biologesch Basis fir Ännerungen am Serummetabolismus verbonne mat bösartigen Transformatioun vu Lungenadenokarzinom.
EGFR Mutatiounen sinn déi heefegst Chauffermutatiounen bei Patienten mat NSCLC.An eiser Etude, hu mir festgestallt, datt Patienten mat EGFR Mutatioun (n = 41) allgemeng metabolomic Profiler ähnlech ze Patienten mat Wild-Typ EGFR (n = 31), obwuel mir ofgeholl serum Niveau vun e puer EGFR mutant Patienten an acylcarnitine Patienten fonnt.Déi etabléiert Funktioun vun Acylcarnitine ass Acylgruppen aus dem Zytoplasma an d'Mitochondrial Matrix ze transportéieren, wat zu der Oxidatioun vu Fettsäuren féiert fir Energie 55 ze produzéieren.Konsequent mat eise Befunde, huet eng rezent Etude och ähnlech Metabolomprofiler tëscht EGFR mutant an EGFR Wild-Typ Tumoren identifizéiert andeems de globale Metabolom vun 102 Lungen Adenocarcinom Tissue Echantillon analyséiert gouf50.Interessanterweis gouf Acylcarnitin Inhalt och an der EGFR mutant Grupp fonnt.Dofir, ob Ännerungen an Acylcarnitin Niveauen EGFR-induzéiert metabolesch Verännerungen reflektéieren an déi ënnerierdesch molekulare Weeër kënne weider Studie verdéngen.
Als Conclusioun etabléiert eis Studie e serum metabolesche Klassifizéierer fir d'Differentialdiagnos vu pulmonaler Knollen a proposéiert e Workflow deen d'Risikobewäertung optiméiere kann an d'klinesch Gestioun erliichtert baséiert op CT Scan Screening.
Dës Etude gouf vun der Ethik Comité vun Sun Yat-sen University Cancer Hospital guttgeheescht, der Éischt Affiliated Spidol vun Sun Yat-sen Universitéit, an der Ethik Comité vun Zhengzhou University Cancer Hospital.An der Entdeckung an intern Validatioun Gruppen, 174 Sera vu gesonden Individuen an 244 Sera aus benign Nodules goufen aus Individuen gesammelt, déi alljährlechen medezinesch Examen am Departement vun Cancer Kontrolléiere a Präventioun, Sun Yat-sen University Cancer Center, an 166 benign Nodules gesammelt.serum.Etapp ech haett adenocarcinomas sech aus Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt.An der externer Validatioun Kohort, goufen et 48 Fäll vun benign nodules, 39 Fäll vun Etapp ech haett adenocarcinoma vun der Éischt verbonne Spidol vun Sun Yat-sen Universitéit, an 24 Fäll vun Etapp ech haett adenocarcinoma aus Zhengzhou Cancer Hospital.Sun Yat-sen University Cancer Center huet och 16 Fäll vu Stadium I Squamous Zell Lungenkrebs gesammelt fir d'diagnostesch Fäegkeet vum etabléierte metabolesche Klassifizéierer ze testen (Patientcharakteristike ginn an der Ergänzungstabell 5 gewisen).Echantillon vun der Entdeckungskohort an der interner Validatiounskohort goufen tëscht Januar 2018 a Mee 2020 gesammelt. Echantillon fir déi extern Validatiounskohort goufen tëscht August 2021 an Oktober 2022 gesammelt. Fir d'Geschlechtbias ze minimiséieren, goufen ongeféier déiselwecht Zuel vu männlechen a weibleche Fäll un all zougewisen. kohort.Entdeckung Team an intern Bewäertung Team.D'Geschlecht vum Participant gouf bestëmmt baséiert op Selbstbericht.Informéiert Zoustëmmung gouf vun all Participanten kritt a keng Entschiedegung gouf geliwwert.Sujete mat benign Nodules waren déi mat engem stabil CT Scanner stoung um 2 bis 5 Joer an der Zäit vun Analyse, ausser 1 Fall vun der externen Validatioun Prouf, déi preoperatively gesammelt an diagnostizéiert vun histopathology.Mat Ausnam vun chronescher Bronchitis.Lung Adenocarcinoma Fäll goufen virum Lungeresektioun gesammelt a bestätegt duerch pathologesch Diagnos.Fasting Blutt Echantillon goufen an Serum Trennung Roueren ouni Anticoagulants gesammelt.Blutt Echantillon sech fir 1 Stonn bei Raumtemperatur clotted an dann centrifuged bei 2851 × g fir 10 Minutten bei 4 ° C Serum supernatant ze sammelen.Serum aliquots sech bei -80 ° C bis metabolite Extraktioun gefruer.D'Departement fir Kriibspräventioun a Medizinesch Untersuchung vum Sun Yat-sen University Cancer Center huet e Pool vu Serum vun 100 gesonde Spender gesammelt, dorënner eng gläich Zuel vu Männer a Fraen am Alter vu 40 bis 55 Joer.Gläich Bänn vun all Spender Prouf goufen gemëscht, déi doraus resultéierend Pool war aliquoted a bei -80 ° C gespäichert.D'Serummëschung gouf als Referenzmaterial fir Qualitéitskontroll an Datenstandardiséierung benotzt.
Referenz Serum an Test Echantillon waren thawed an metabolites sech mat enger kombinéiert Extraktioun Method (MTBE / Methanol / Waasser) 56 extrahéiert.Kuerz gesot, 50 μl Serum gouf mat 225 μl äiskalem Methanol an 750 μl äiskalem Methyltert-Butylether (MTBE) gemëscht.Stir d'Mëschung an inkubéiert op Äis fir 1 Stonn.D'Echantillon goufen dann gemëscht a Wirbel gemëscht mat 188 μl MS-Schouljoer Waasser mat internen Normen (13C-Laktat, 13C3-Pyruvat, 13C-Methionin, an 13C6-Isoleucin, kaaft vu Cambridge Isotope Laboratories).D'Mëschung gouf duerno bei 15.000 × g fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert, an déi ënnescht Phase gouf an zwee Réier (125 μL all) fir LC-MS Analyse a positiven an negativen Modi transferéiert.Schlussendlech gouf d'Probe op d'Trockheet an engem Héichgeschwindeg Vakuumkonzentrator verdampft.
Déi gedréchent Metaboliten goufen an 120 μl 80% Acetonitril rekonstituéiert, fir 5 min gevortexéiert a bei 15.000 × g fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert.Supernatanten goufen an Amber Glasfläschen mat Mikroinserts fir Metabolomikstudien transferéiert.Ongeziilte Metabolomik Analyse op enger Ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS) Plattform.Metaboliten goufen mat engem Dionex Ultimate 3000 UPLC System an enger ACQUITY BEH Amide Kolonn (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waasser) getrennt.Am positive Ion Modus waren déi mobil Phasen 95% (A) an 50% Acetonitril (B), all mat 10 mmol / L Ammoniumacetat an 0,1% Mieresäure.Am negativen Modus, mobil Phasen A a B enthalen 95% a 50% Acetonitril, respektiv, béid Phasen enthalen 10 mmol / L Ammoniumacetat, pH = 9. De Gradientprogramm war wéi follegt: 0-0,5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12–14 min, 50–98% B;14-16 min, 98% B;16-16.1.min, 98-2% B;16,1-20 min, 2% B. D'Kolonn gouf bei 40 ° C an d'Probe bei 10 ° C am Autosampler behalen.De Flowrate war 0,3 ml / min, d'Injektiounsvolumen war 3 μl.E Q-Exactive Orbitrap Massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) mat enger Elektrospray Ioniséierung (ESI) Quell gouf am Vollscanmodus operéiert a mat dem ddMS2 Iwwerwaachungsmodus gekoppelt fir grouss Bänn vun Daten ze sammelen.D'MS Parameter goufen wéi follegt agestallt: Sprayspannung +3,8 kV/- 3,2 kV, Kapillartemperatur 320°C, Schirmgas 40 arb, Hëllefsgas 10 arb, Sondeheizungstemperatur 350°C, Scannenberäich 70–1050 m/h, Resolutioun.70 000. Donnéeën goufen mat Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) kaaft.
Fir d'Datequalitéit ze bewäerten, goufen pooléiert Qualitéitskontroll (QC) Echantillon generéiert andeems 10 μL Aliquots vun der Supernatant aus all Probe geläscht ginn.Sechs Qualitéitskontroll Probe Injektiounen goufen am Ufank vun der analytescher Sequenz analyséiert fir d'Stabilitéit vum UPLC-MS System ze bewäerten.Qualitéitskontrollproben ginn dann periodesch an d'Batch agefouert.All 11 Chargen vun serum Echantillon an dëser Etude goufen duerch LC-MS analyséiert.Aliquots vun enger Serum-Pool-Mëschung aus 100 gesonde Spender goufen als Referenzmaterial a jeweilege Chargen benotzt fir den Extraktiounsprozess ze iwwerwaachen a fir Batch-zu-Batch Effekter unzepassen.Ongeziilte Metabolomik Analyse vun der Entdeckungskohort, interner Validatiounskohort an externer Validatiounskohort gouf am Metabolomics Center vun der Sun Yat-sen University gemaach.Den externen Laboratoire vun der Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center huet och 40 Proben aus der externer Kohort analyséiert fir d'Performance vum Klassifizéierungsmodell ze testen.
No Extraktioun a Rekonstitutioun gouf d'absolut Quantitatioun vu Serummetaboliten gemooss mat ultra-héichleistungsflëssege Chromatographie-Tandem Massespektrometrie (Agilent 6495 Triple Quadrupole) mat enger Elektrospray Ioniséierung (ESI) Quell a Multiple Reaction Monitoring (MRM) Modus.Eng ACQUITY BEH Amide Kolonn (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waasser) gouf benotzt fir Metaboliten ze trennen.Déi mobil Phase bestoung aus 90% (A) a 5% Acetonitril (B) mat 10 mmol / L Ammoniumacetat an 0,1% Ammoniakléisung.De Gradientprogramm war wéi follegt: 0-1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.D'Kolonn gouf bei 40 ° C gehal an d'Probe bei 10 ° C am Autosampler.De Flowrate war 0,3 ml /min an d'Injektiounsvolumen war 1 μL.MS Parameteren goufen wéi follegt gesat: kapillär Volt ± 3,5 kV, nebulizer Drock 35 psi, sheath Gas Flux 12 L / min, sheath Gas Temperatur 350 ° C, Dréchent Gas Temperatur 250 ° C, an Dréchent Gas Flux 14 l / min.D'MRM Konversioune vun Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin an Xanthin waren 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 an 151,0-107.9 respektiv.Donnéeën goufen benotzt Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) gesammelt.Fir Serum Echantillon, Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin, an Xanthin goufen quantifizéiert mat Eechungskurven vu Standardmëschungsléisungen.Fir Zell Echantillon, war Tryptophan Inhalt op den internen Standard an Zell Protein Mass normaliséiert.
Peak Extraktioun (m /z an Retentioun Zäit (RT)) war mat Compound Discovery 3.1 an TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) gesuergt.Fir potenziell Differenzen tëscht Chargen ze eliminéieren, gouf all charakteristesch Peak vun der Testprobe duerch de charakteristesche Peak vum Referenzmaterial aus der selwechter Charge gedeelt fir de relativen Heefegkeet ze kréien.Déi relativ Standarddeviatioune vun internen Normen virun an no der Standardiséierung sinn an der Ergänzungstabelle 6. Differenzen tëscht den zwou Gruppen goufen duerch falsch Entdeckungsquote (FDR <0,05, Wilcoxon ënnerschriwwen Ranktest) a Fold änneren (> 1,2 oder <0,83) charakteriséiert.Raw MS Daten vun den extrahéierten Features a Referenzserum-korrigéierten MS Daten ginn an Supplementary Data 1 respektiv Supplementary Data 2 gewisen.Peak Annotatioun gouf op Basis vu véier definéierten Niveauen vun der Identifikatioun gemaach, dorënner identifizéiert Metaboliten, putativ annotéiert Verbindungen, putativ charakteriséiert Verbindungsklassen an onbekannte Verbindungen 22.Baséierend op Datebank Sichen am Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biologesch Verbindunge mat MS / MS passende validéierte Standarden oder exakt Match Annotatiounen am mzCloud (Score> 85) oder Chemspider goufen endlech als Zwëscheprodukter tëscht dem differentiellen Metabolom ausgewielt.Peak Annotatiounen fir all Feature sinn an Ergänzungsdaten abegraff 3. MetaboAnalyst 5.0 gouf fir univariate Analyse vun der Zommnormaliséierter Metabolit Heefegkeet benotzt.MetaboAnalyst 5.0 huet och KEGG Pathway Beräicherungsanalyse evaluéiert baséiert op wesentlech verschiddene Metaboliten.Haaptkomponent Analyse (PCA) an deelweis mannst Quadrat diskriminant Analyse (PLS-DA) goufen analyséiert mat der ropls Software Package (v.1.26.4) mat Stack Normaliséierung an autoscaling.Den optimalen Metabolit-Biomarker-Modell fir d'Nodule-Malignitéit virauszesoen gouf generéiert mat binäre logistesche Réckgang mat mannst absolute Schrumpfung a Selektiounsbedreiwer (LASSO, R Package v.4.1-3).D'Performance vum diskriminante Modell an der Detektiouns- a Validatiounssätz gouf charakteriséiert duerch Schätzung vun AUC baséiert op ROC Analyse no dem pROC Package (v.1.18.0.).Déi optimal Wahrscheinlechkeet cutoff war baséiert op der maximal Youden Index vum Modell kritt (Sensibilitéit + Spezifizitéit - 1).Echantillon mat Wäerter manner oder méi wéi d'Schwell ginn als benign Knollen a Lungen Adenokarcinom virausgesot, respektiv.
A549 Zellen (# CCL-185, American Typ Kultur Collection) sech am F-12K mëttelfristeg mat 10% FBS ugebaut.Kuerz Haarnadel RNA (shRNA) Sequenzen, déi SLC7A5 zielen an eng nontargeting Kontroll (NC) goufen an de lentivirale Vektor pLKO.1-puro agebaut.D'Antisense Sequenze vu shSLC7A5 sinn wéi follegt: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Antikörper zu SLC7A5 (#5347) an Tubulin (#2148) goufen aus Zell Signal Technologie kaaft.Antibodies zu SLC7A5 an tubulin sech bei enger dilution vun 1:1000 fir Western blot Analyse benotzt.
De Seahorse XF Glycolytic Stress Test moosst extrazellulär Säurungsniveauen (ECAR).Am Assay goufen Glukos, Oligomycin A, an 2-DG sequenziell verwalt fir bewosst glycolytesch Kapazitéit ze testen wéi vun ECAR gemooss.
A549 Zellen transfected mat Net-Targeting Kontroll (NC) an shSLC7A5 (Sh1, Sh2) goufen iwwer Nuecht an 10 cm Duerchmiesser Platen plated.Zell Metabolite goufen mat 1 ml vun äiskal 80% wässerlech Methanol extrahéiert.Zellen an der Methanol Léisung goufen ofgerappt, an en neit Rouer gesammelt, a bei 15.000 × g fir 15 min bei 4 ° C centrifugéiert.Sammelt 800 μl Supernatant a trocken mat engem Héichgeschwindeg Vakuumkonzentrator.Déi gedréchent Metabolitpellets goufen dunn fir Tryptophanniveauen analyséiert mat LC-MS /MS wéi uewen beschriwwen.Zellular NAD (H) Niveauen an A549 Zellen (NC an shSLC7A5) goufen mat engem quantitative NAD + /NADH colorimetric Kit (# K337, BioVision) gemooss no den Instruktioune vum Hiersteller.Proteinniveauen goufen fir all Probe gemooss fir d'Quantitéit u Metaboliten ze normaliséieren.
Keng statistesch Methode goufen benotzt fir d'Proufgréisst virleefeg ze bestëmmen.Virdrun metabolomics Studien op Biomarker Entdeckung riicht 15,18 goufen als Benchmarks fir Gréisst Bestëmmung considéréiert, a Verglach zu dëse Rapporten, eis Prouf war adäquat.Keng Echantillon waren aus der Etude Kohort ausgeschloss.Serum Echantillon waren zoufälleg zu enger Entdeckung Grupp zougewisen (306 Fäll, 74.6%) an eng intern Validatioun Grupp (104 Fäll, 25.4%) fir untargeted metabolomics Studien.Mir hunn och zoufälleg 70 Fäll aus all Grupp aus der Entdeckung fir geziilte metabolomics Studien ausgewielt.D'Enquêteure goufen op d'Grupp Aufgab während der LC-MS Datensammlung an Analyse blann.Statistesch Analyse vun metabolomics Daten an Zell Experimenter sinn am jeeweileg Resultater beschriwwen, Figur Legends, a Methoden Rubriken.Quantifikatioun vun Zell Tryptophan, NADT, a glycolytic Aktivitéit war dräimol onofhängeg mat identesch Resultater duerchgefouert.
Fir méi Informatioun iwwer de Studiedesign, kuckt den Natural Portfolio Report Abstract mat dësem Artikel assoziéiert.
Déi rau MS Daten vun den extrahéierten Features an déi normaliséiert MS Daten vum Referenzserum ginn an Supplementary Data 1 respektiv Supplementary Data 2 gewisen.Peak Annotatiounen fir differenziell Funktiounen ginn an Ergänzungsdaten presentéiert 3. D'LUAD TCGA Dataset kann erofgeluede ginn https://portal.gdc.cancer.gov/.D'Inputdaten fir d'Grafik ze plotten ginn an de Quelldaten geliwwert.Quelldaten gi fir dësen Artikel zur Verfügung gestallt.
National Lung Screening Study Group, etc.Norden England.J. Med.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC.J. Med.Écran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Reduzéieren Lungenkrebs Mortalitéit mat volumetresche CT Screening an engem randomiséierte Prozess.Norden England.J. Med.382, 503–513 (2020).
Post Zäit: Sep-18-2023