D'Differenzialdiagnos vu pulmonalen Knäppchen, déi duerch Computertomographie (CT) identifizéiert ginn, bleift eng Erausfuerderung an der klinescher Praxis. Hei charakteriséiere mir de globale Metabolom vu 480 Serumprouwen, dorënner gesond Kontrollpersounen, guttartigen Lungenknäppchen a Lungenadenokarzinom am Stadium I. Adenokarzinome weisen eenzegaarteg metabolomesch Profiler op, während guttartigen Knäppchen a gesond Individuen eng héich Ähnlechkeet an de metabolomesche Profiler hunn. An der Discovery-Grupp (n = 306) gouf eng Grupp vun 27 Metabolitten identifizéiert fir tëscht guttartigen a bösartigen Knäppchen z'ënnerscheeden. Den AUC vum Diskriminatiounsmodell an der interner Validatiouns- (n = 104) an externer Validatiouns- (n = 111) Grupp war 0,915 respektiv 0,945. D'Weeëranalyse huet eng erhéicht glykolytesch Metabolitt gewisen, déi mat engem reduzéierten Tryptophan am Lungenadenokarzinom-Serum assoziéiert ass, am Verglach mat guttartigen Knäppchen a gesonde Kontrollpersounen, an huet drop higewisen, datt d'Tryptophan-Opnahm d'Glykolyse a Lungenkrebszellen fördert. Eis Studie ënnersträicht de Wäert vu Serummetabolit-Biomarker fir d'Bewäertung vum Risiko vu pulmonalen Knötchen, déi duerch CT entdeckt goufen.
Eng fréi Diagnos ass entscheedend fir d'Iwwerliewensquote vu Kriibspatienten ze verbesseren. Resultater vum US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) an der Europäescher NELSON-Studie hunn gewisen, datt Screening mat Low-Dose Computertomographie (LDCT) d'Mortalitéit duerch Lungenkriibs a Risikogruppen däitlech reduzéiere kann1,2,3. Zënter der verbreeter Notzung vun LDCT fir Lungenkriibsscreening ass d'Inzidenz vun zoufällegen radiologesche Befunde vun asymptomatesche Lungenknäppchen weider eropgaang4. Lungenknäppchen ginn als fokal Opacitéiten bis zu 3 cm am Duerchmiesser definéiert5. Mir hunn Schwieregkeeten, d'Wahrscheinlechkeet vun enger Malignitéit ze bewäerten an mat der grousser Zuel vu Lungenknäppchen ëmzegoen, déi zoufälleg bei LDCT entdeckt ginn. D'Aschränkunge vun der CT kënnen zu heefege Follow-up-Untersuchungen a falsch-positive Resultater féieren, wat zu onnéideger Interventioun an Iwwerbehandlung6 féiert. Dofir ass et néideg, zouverlässeg a nëtzlech Biomarker z'entwéckelen, fir Lungenkriibs an de fréie Stadien korrekt z'identifizéieren an déi meescht guttartigen Knäppchen bei der initialer Detektioun z'ënnerscheeden7.
Eng ëmfaassend molekular Analyse vu Blutt (Serum, Plasma, periphere Bluttmononuklearzellen), inklusiv Genomik, Proteomik oder DNA-Methylierung8,9,10, huet zu engem wuessenden Interessi un der Entdeckung vun diagnostesche Biomarker fir Lungenkrebs gefouert. Mëttlerweil moossen d'Metabolomik-Approchen zellulär Endprodukter, déi vun endogenen an exogenen Aktiounen beaflosst ginn a dofir ugewannt ginn, fir den Ufank an d'Resultat vun der Krankheet virauszesoen. Flëssegchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) ass eng wäit verbreet Method fir Metabolomik-Studien wéinst hirer héijer Empfindlechkeet a sengem grousse dynamesche Beräich, déi Metabolitte mat verschiddene physikochemesche Eegeschafte11,12,13 ofdecke kann. Obwuel eng global metabolomesch Analyse vu Plasma/Serum benotzt gouf, fir Biomarker z'identifizéieren, déi mat der Diagnos vun der Lungenkrebs14,15,16,17 an der Behandlungseffizienz assoziéiert sinn,18 musse Serummetabolit-Klassifizéierer, fir tëscht benignen a bösartigen Lungenknäppchen z'ënnerscheeden, nach vill studéiert ginn. -massiv Fuerschung.
Adenokarzinom a Plattenepithelkarzinom sinn déi zwee Haaptënnertypen vum net-klengzellige Lungenkrebs (NSCLC). Verschidde CT-Screeningtester weisen drop hin, datt Adenokarzinom déi heefegst histologesch Aart vu Lungenkrebs ass1,19,20,21. An dëser Studie hu mir Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie-Héichopléisungsmassenspektrometrie (UPLC-HRMS) benotzt fir eng Metabolomikanalyse op insgesamt 695 Serumprouwen duerchzeféieren, dorënner gesond Kontrollpersounen, guttartigen Lungenknäppchen an CT-detektéiert ≤3 cm. Screening fir Lungenadenokarzinom am Stadium I. Mir hunn e Panel vu Serummetabolitten identifizéiert, déi Lungenadenokarzinom vun guttartigen Knäppchen a gesonde Kontrollpersounen ënnerscheeden. D'Analyse vun der Anreicherung vun de Pathways huet gewisen, datt anormalen Tryptophan- a Glukosmetabolismus heefeg Verännerungen beim Lungenadenokarzinom am Verglach mat guttartigen Knäppchen a gesonde Kontrollpersounen sinn. Schlussendlech hu mir e Serummetabolismus-Klassifikator mat héijer Spezifizitéit a Sensibilitéit etabléiert a validéiert, fir tëscht bösarte a benigne Lungenknäppchen z'ënnerscheeden, déi duerch LDCT entdeckt goufen, wat bei enger fréicher Differenzialdiagnos an enger Risikobewertung hëllefe kann.
An der aktueller Studie goufen no Geschlecht an Alter retrospektiv Serumprouwen vun 174 gesonde Kontrollpersounen, 292 Patienten mat benignen Lungenknäppchen an 229 Patienten mat Lungenadenokarzinom am Stadium I gesammelt. Déi demographesch Charakteristike vun den 695 Persounen sinn an der Ergänzungstabell 1 gewisen.
Wéi an der Figur 1a gewisen, goufen am Ganzen 480 Serumprouwen, dorënner 174 gesond Kontrollprouwen (HC), 170 guttartigen Nodulen (BN) a 136 Lungenadenokarzinomprouwen (LA) am Stadium I, am Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt. Discovery-Kohort fir ongezielt metabolisch Profiléierung mat Hëllef vun Ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS). Wéi an der Ergänzungsfigur 1 gewisen, goufen differentiell Metabolitte tëscht LA an HC, LA a BN identifizéiert fir e Klassifikatiounsmodell opzebauen an d'Differenzial-Weeër-Analyse weider z'ënnersichen. 104 Prouwen, déi vum Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt goufen, an 111 Prouwen, déi vun zwee anere Spideeler gesammelt goufen, goufen intern respektiv extern validéiert.
a Studienpopulatioun an der Discovery-Kohort, déi eng global Serummetabolomik-Analyse mat Hëllef vun Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie-Héichopléisungsmassenspektrometrie (UPLC-HRMS) gemaach huet. b Partiell Klengstquadrat-Diskriminantanalyse (PLS-DA) vum gesamte Metabolom vu 480 Serumprouwen aus der Studienkohort, dorënner gesond Kontrollen (HC, n = 174), guttartigen Nodulen (BN, n = 170) a Lungenadenokarzinom am Stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiven Elektrospray-Ioniséierungsmodus, -ESI, negativen Elektrospray-Ioniséierungsmodus. c–e Metabolitte mat signifikant ënnerschiddlechen Heefegkeeten an zwou bestëmmte Gruppen (zweischwänzege Wilcoxon-signed-Rang-Test, falsch-Discovery-Rate-ugepassten p-Wäert, FDR <0,05) ginn a rout (Fold-Ännerung > 1,2) a blo (Fold-Ännerung < 0,83) op der Vulkangrafik gewisen. f Hierarchesch Clustering-Hëtztkaart, déi signifikant Ënnerscheeder an der Zuel vun annotéierte Metabolitte tëscht LA an BN weist. D'Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
De gesamte Serummetabolom vun 174 HC, 170 BN an 136 LA an der Discovery-Grupp gouf mat Hëllef vun der UPLC-HRMS-Analyse analyséiert. Mir weisen als éischt, datt Qualitéitskontroll- (QC)-Prouwen enk an der Mëtt vun engem net iwwerwaachte Principal Component Analysis (PCA)-Modell zesummekommen, wat d'Stabilitéit vun der Leeschtung vun der aktueller Studie bestätegt (Ergänzungsfigur 2).
Wéi an der partieller Klengstquadrat-Diskriminantanalyse (PLS-DA) an der Figur 1b gewisen, hu mir festgestallt, datt et kloer Ënnerscheeder tëscht LA an BN, LA an HC a positiven (+ESI) an negativen (-ESI) Elektrospray-Ioniséierungsmodi isoléiert gouf. Wéi och ëmmer, goufen keng signifikant Ënnerscheeder tëscht BN an HC a +ESI- a -ESI-Konditioune fonnt.
Mir hunn 382 Differenzialmerkmale tëscht LA an HC, 231 Differenzialmerkmale tëscht LA an BN, an 95 Differenzialmerkmale tëscht BN an HC (Wilcoxon Signed Rank Test, FDR <0,05 a Multiple Change >1,2 oder <0,83) fonnt (Figur .1c-e). . D'Peaken goufen weider annotéiert (Ergänzungsdaten 3) géint eng Datebank (mzCloud/HMDB/Chemspider Bibliothéik) duerch m/z-Wäert, Retentiounszäit a Fragmentéierungsmassespektrumsich (Detailer an der Methodsektioun beschriwwen) 22. Schlussendlech goufen 33 an 38 annotéiert Metabolitte mat signifikanten Ënnerscheeder an der Heefegkeet fir LA versus BN (Figur 1f an Ergänzungstabell 2) a LA versus HC (Ergänzungsfigur 3 an Ergänzungstabell 2) identifizéiert. Am Géigesaz dozou goufen nëmmen 3 Metabolitte mat signifikanten Ënnerscheeder an der Heefegkeet a BN an HC identifizéiert (Ergänzungstabell 2), wat mat der Iwwerlappung tëscht BN an HC a PLS-DA konsequent ass. Dës differenziell Metabolitte decken eng breet Palette vu Biochemie of (Ergänzungsfigur 4). Zesummegeholl weisen dës Resultater bedeitend Verännerungen am Serummetabolom, déi eng bösarteg Transformatioun vu Lungenkrebs am fréie Stadium am Verglach mat benignen Lungenknäppchen oder gesonde Persounen reflektéieren. Mëttlerweil weist d'Ähnlechkeet vum Serummetabolom vu BN an HC drop hin, datt benign Lungenknäppchen vill biologesch Charakteristike mat gesonde Persoune deele kënnen. Well d'Genmutatiounen am Epidermal Growth Factor Rezeptor (EGFR) heefeg beim Lungenadenokarzinom-Subtyp 23 sinn, hu mir versicht, den Impakt vun den Treibermutatiounen op de Serummetabolom ze bestëmmen. Mir hunn dann de gesamte metabolesche Profil vun 72 Fäll mat EGFR-Status an der Lungenadenokarzinomgrupp analyséiert. Interessanterweis hu mir vergläichbar Profiler tëscht EGFR-Mutantpatienten (n = 41) an EGFR-Wildtyppatienten (n = 31) an der PCA-Analyse fonnt (Ergänzungsfigur 5a). Mir hunn awer 7 Metabolitte identifizéiert, deenen hir Heefegkeet bei Patienten mat EGFR-Mutatioun am Verglach zu Patienten mat Wildtyp-EGFR signifikant verännert war (t-Test, p < 0,05 a Faltännerung > 1,2 oder < 0,83) (Ergänzungsfigur 5b). Déi meescht vun dëse Metabolitte (5 vu 7) sinn Acylcarnitine, déi eng wichteg Roll an de Fettsäureoxidatiounsweeër spillen.
Wéi am Workflow an der Figur 2a illustréiert, goufen Biomarker fir d'Klassifikatioun vun den Nodulen mat Hëllef vun Operatoren fir déi klengst absolut Schrumpfung an enger Selektioun baséiert op 33 differentiellen Metabolitten, déi an LA (n = 136) an BN (n = 170) identifizéiert goufen, kritt. Déi bescht Kombinatioun vu Variablen (LASSO) - binärt logistescht Regressiounsmodell. Eng zéngfach Kräizvalidatioun gouf benotzt fir d'Zouverlässegkeet vum Modell ze testen. D'Variabelauswiel an d'Parameterregulariséierung ginn duerch eng Likelihoodmaximiséierungspenalty mam Parameter λ24 ugepasst. Eng global Metabolomikanalyse gouf weider onofhängeg an der interner Validatiouns- (n = 104) an externer Validatiouns- (n = 111) Grupp duerchgefouert fir d'Klassifikatiounsleistung vum Diskriminantmodell ze testen. Als Resultat goufen 27 Metabolitten am Discovery Set als dat bescht Diskriminantmodell mam gréissten duerchschnëttlechen AUC-Wäert identifizéiert (Fig. 2b), vun deenen 9 eng erhéicht Aktivitéit an 18 eng reduzéiert Aktivitéit an LA am Verglach zum BN haten (Fig. 2c).
Workflow fir d'Erstelle vun engem Klassifizéierer fir pulmonal Knuet, inklusiv der Auswiel vum beschte Panel vu Serummetabolitten am Discovery Set mat Hëllef vun engem binäre logistesche Regressiounsmodell iwwer zéngfach Kräizvalidatioun an der Evaluatioun vun der prädiktiver Leeschtung an internen an externen Validatiounssätz. b Kräizvalidatiounsstatistik vum LASSO-Regressiounsmodell fir d'Auswiel vu metabolesche Biomarker. Déi uewe genannten Zuelen representéieren déi duerchschnëttlech Zuel vu Biomarker, déi bei engem bestëmmte λ ausgewielt goufen. Déi rout gepunkelt Linn representéiert den duerchschnëttlechen AUC-Wäert bei der entspriechender Lambda. Gro Feelerbalken representéieren déi minimal an maximal AUC-Wäerter. Déi gepunkelt Linn weist dat bescht Modell mat den 27 ausgewielte Biomarker un. AUC, Fläch ënner der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve. c Ännerungen an der Fläch vun 27 ausgewielte Metabolitten an der LA-Grupp am Verglach mat der BN-Grupp an der Discovery-Grupp. Rout Kolonn - Aktivéierung. Déi blo Kolonn ass en Réckgang. d–f Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven, déi d'Kraaft vum Diskriminatiounsmodell op Basis vun 27 Metabolitkombinatiounen an den Discovery-, internen an externen Validatiounssätz weisen. D'Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
E Prognosemodell gouf op Basis vun de gewichtete Regressiounskoeffizienten vun dësen 27 Metabolitten erstallt (Ergänzungstabell 3). D'ROC-Analyse op Basis vun dësen 27 Metabolitten huet eng Fläch ënner der Kurve (AUC) Wäert vun 0,933 erginn, d'Sensibilitéit vun der Discovery Group war 0,868 an d'Spezifizitéit war 0,859 (Fig. 2d). Mëttlerweil huet ënner den 38 annotéierten Differenzmetabolitten tëscht LA an HC eng Grupp vun 16 Metabolitten eng AUC vun 0,902 mat enger Sensibilitéit vun 0,801 an enger Spezifizitéit vun 0,856 bei der Ënnerscheedung tëscht LA an HC erreecht (Ergänzungsfigur 6a-c). AUC-Wäerter op Basis vun ënnerschiddleche Faltännerungsschwellen fir differentiell Metabolitten goufen och verglach. Mir hunn festgestallt, datt de Klassifikatiounsmodell am beschten tëscht LA an BN (HC) ënnerscheet huet, wann de Faltännerungsniveau op 1,2 am Verglach zu 1,5 oder 2,0 festgeluecht war (Ergänzungsfigur 7a,b). De Klassifikatiounsmodell, baséiert op 27 Metabolitgruppen, gouf weider an internen an externen Kohorten validéiert. Den AUC war 0,915 (Sensibilitéit 0,867, Spezifizitéit 0,811) fir intern Validatioun an 0,945 (Sensibilitéit 0,810, Spezifizitéit 0,979) fir extern Validatioun (Fig. 2e, f). Fir d'Effizienz vun den Interlaboratoiren ze evaluéieren, goufen 40 Proben aus der externer Kohort an engem externen Laboratoire analyséiert, wéi an der Methodesektioun beschriwwen. D'Genauegkeet vun der Klassifikatioun huet en AUC vun 0,925 erreecht (Ergänzungsfigur 8). Well de Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC) den zweetheefegsten Ënnertyp vun net-klengzelligem Lungenkriibs (NSCLC) nom Lungenadenokarzinom (LUAD) ass, hu mir och de validéierte potenziellen Notzen vu metabolesche Profiler getest. BN an 16 Fäll vu LUSC. Den AUC vun der Ënnerscheedung tëscht LUSC a BN war 0,776 (Ergänzungsfigur 9), wat op eng méi schlecht Fäegkeet am Verglach zur Ënnerscheedung tëscht LUAD a BN hiweist.
Studien hunn gewisen, datt d'Gréisst vun den Nodulen op CT-Biller positiv mat der Wahrscheinlechkeet vun enger Malignitéit korreléiert ass a weiderhin e wichtegen Determinant vun der Nodulbehandlung ass25,26,27. D'Analyse vun den Donnéeën aus der grousser Kohort vun der NELSON-Screeningstudie huet gewisen, datt de Risiko vun enger Malignitéit bei Persounen mat Nodulen <5 mm souguer ähnlech war wéi dee bei Persounen ouni Nodulen28. Dofir ass déi minimal Gréisst, déi reegelméisseg CT-Iwwerwaachung erfuerdert, 5 mm, wéi vun der British Thoracic Society (BTS) recommandéiert, a 6 mm, wéi vun der Fleischner Society recommandéiert29. Wéi och ëmmer, Nodulen, déi méi grouss wéi 6 mm sinn an ouni offensichtlech guttartigen Eegeschaften, déi onbestëmmt pulmonal Nodulen (IPN) genannt ginn, bleiwen eng grouss Erausfuerderung bei der Evaluatioun a Behandlung an der klinescher Praxis30,31. Mir hunn duerno ënnersicht, ob d'Gréisst vun den Nodulen d'metabolomesch Signaturen beaflosst huet, andeems mir gepoolte Proben aus den Discovery- a interner Validatiounskohorten benotzt hunn. Mir hunn eis op 27 validéiert Biomarker konzentréiert a fir d'éischt d'PCA-Profiler vun HC- a BN-Metabolomen ënner 6 mm verglach. Mir hunn festgestallt, datt déi meescht Datenpunkte fir HC an BN sech iwwerlappt hunn, wat beweist, datt d'Serummetabolitniveauen an deenen zwou Gruppen ähnlech waren (Fig. 3a). D'Featurekaarte fir verschidde Gréisstberäicher si bei BN an LA konservéiert bliwwen (Fig. 3b, c), während eng Trennung tëscht bösartigen a benignen Knëtschen am Beräich vun 6–20 mm observéiert gouf (Fig. 3d). Dës Kohort hat en AUC vun 0,927, eng Spezifizitéit vun 0,868 an eng Sensibilitéit vun 0,820 fir d'Prognose vun der Malignitéit vun Knëtschen mat engem Gréisst vun 6 bis 20 mm (Fig. 3e, f). Eis Resultater weisen, datt de Klassifizéierer metabolesch Verännerungen, déi duerch eng fréi bösarteg Transformatioun verursaacht ginn, onofhängeg vun der Gréisst vum Knëtsch erfaasse kann.
ad Vergläich vu PCA-Profiler tëscht spezifizéierte Gruppen baséiert op engem metabolesche Klassifizéierer vu 27 Metabolitten. CC an BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. an LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm an LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver Operating Characteristic (ROC) Kurve, déi d'Diskriminantmodellleistung fir Knuetchen vun 6–20 mm weist. f Wahrscheinlechkeetswäerter goufen op Basis vum logistesche Regressiounsmodell fir Knuetchen mat enger Gréisst vun 6–20 mm berechent. Déi gro gepunktete Linn representéiert de optimale Grenzwäert (0,455). D'Zuelen uewen representéieren de Prozentsaz vun de Fäll, déi fir Los Angeles projetéiert ginn. Benotzt en zweesäitege Student's t-Test. PCA, Haaptkomponentenanalyse. AUC-Fläch ënner der Kurve. Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
Véier Proben (am Alter vun 44–61 Joer) mat ähnleche Gréissten vun de pulmonalen Knäppchen (7–9 mm) goufen weider ausgewielt, fir d'Leeschtung vum proposéierte Modell fir d'Prognose vu Malignitéiten ze illustréieren (Fig. 4a, b). Beim initialen Screening huet sech de Fall 1 als e festen Knäppchen mat Verkalkung presentéiert, e Merkmal, dat mat Benignitéit assoziéiert gëtt, während de Fall 2 sech als en onbestëmmten, deelweis festen Knäppchen ouni offensichtlech benign Merkmal presentéiert huet. Dräi Ronne vun CT-Scanne mat Follow-up-Scanne hunn gewisen, datt dës Fäll iwwer eng Period vu 4 Joer stabil bliwwe sinn a dofir als benign Knäppchen ugesi goufen (Fig. 4a). Am Verglach mat der klinescher Evaluatioun vu serielle CT-Scanne huet d'Single-Shot-Serummetabolitanalyse mam aktuelle Klassifizéierermodell dës benign Knäppchen séier an korrekt op Basis vu probabilistesche Restriktiounen identifizéiert (Tabell 1). D'Figur 4b am Fall 3 weist en Knäppchen mat Zeeche vun enger pleuraler Retraktioun, déi am heefegsten mat Malignitéit assoziéiert ass32. De Fall 4 huet sech als en onbestëmmten, deelweis festen Knäppchen ouni Beweis fir eng benign Ursaach presentéiert. All dës Fäll goufen no dem Klassifizéierermodell als bösarteg virausgesot (Tabell 1). D'Bewäertung vum Lungenadenokarzinom gouf duerch histopathologesch Untersuchung no enger Lungenresektionsoperatioun demonstréiert (Fig. 4b). Fir de externen Validatiounsset huet de metabolesche Klassifizéierer zwou Fäll vun onbestëmmten Lungenknäppchen, déi méi grouss wéi 6 mm sinn, korrekt virausgesot (Ergänzungsfigur 10).
CT-Biller vum axialen Fënster vun de Longen vun zwéi Fäll vu benignen Nodulen. Am Fall 1 huet den CT-Scan no 4 Joer en stabilen, festen Nodul mat enger Gréisst vu 7 mm an enger Verkalkung am rietsen ënneschten Lappen gewisen. Am Fall 2 huet den CT-Scan no 5 Joer en stabilen, deelweis festen Nodul mat engem Duerchmiesser vu 7 mm am rietsen ieweschten Lappen gewisen. b Axialen Fënster-CT-Biller vun de Longen a korrespondéierend pathologesch Studien vun zwéi Fäll vun Adenokarzinom am Stadium I virun der Lungenresektion. Fall 3 huet en Nodul mat engem Duerchmiesser vun 8 mm am rietsen ieweschten Lappen mat Pleuraretraktioun gewisen. Fall 4 huet en deelweis festen, mat engem Duerchmiesser vu 9 mm am lénksen ieweschten Lappen gewisen. Hämatoxylin- an Eosin- (H&E)-Färbung vum resektionéierte Longengewebe (Skala-Bal = 50 μm) weist dat azinärt Wuessmuster vum Lungenadenokarzinom. D'Feiler weisen Nodulen un, déi op CT-Biller festgestallt goufen. H&E-Biller si representativ Biller vu verschiddene (>3) mikroskopesche Felder, déi vum Patholog ënnersicht goufen.
Zesummegefaasst weisen eis Resultater de potenziellen Wäert vu Serummetabolit-Biomarker an der Differenzdiagnos vu Lungenknäppchen, wat Erausfuerderunge bei der Evaluatioun vum CT-Screening duerstelle kann.
Baséierend op engem validéierten Differentialmetabolit-Panel, hu mir versicht, biologesch Korrelate vu groussen metabolesche Verännerungen z'identifizéieren. D'KEGG-Signalwee-Beräicherungsanalyse vum MetaboAnalyst huet 6 gemeinsam signifikant verännert Signalweeër tëscht den zwou Gruppen identifizéiert (LA vs. HC an LA vs. BN, ugepasst p ≤ 0,001, Effekt > 0,01). Dës Verännerunge ware charakteriséiert duerch Stéierungen am Pyruvat-Metabolismus, Tryptophan-Metabolismus, Niacin- an Nikotinamid-Metabolismus, Glykolyse, dem TCA-Zyklus a Purin-Metabolismus (Fig. 5a). Mir hunn duerno weider gezielt Metabolomik duerchgefouert, fir grouss Verännerungen mat absoluter Quantifizéierung ze verifizéieren. Bestëmmung vun gemeinsame Metabolitten an allgemeng verännerte Signalweeër duerch Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (QQQ) mat authentesche Metabolitstandarden. Déi demographesch Charakteristike vun der Zilprobe vun der Metabolomikstudie sinn an der Ergänzungstabell 4 abegraff. Am Aklang mat eise globale Metabolomikresultater huet d'quantitativ Analyse bestätegt, datt Hypoxanthin an Xanthin, Pyruvat a Laktat bei LA am Verglach zu BN an HC erhéicht waren (Fig. 5b, c, p <0,05). Wéi och ëmmer, goufen keng signifikant Ënnerscheeder an dëse Metabolitte tëscht BN an HC festgestallt.
KEGG-Signalwee-Anreicherungsanalyse vu signifikant ënnerschiddleche Metabolitten an der LA-Grupp am Verglach mat de BN- an HC-Gruppen. E zweesäitege Globaltest gouf benotzt, an d'p-Wäerter goufen mat der Holm-Bonferroni-Method ugepasst (ugepasst p ≤ 0,001 an Effektgréisst > 0,01). b–d Violin-Diagrammer, déi d'Hypoxanthin-, Xanthin-, Laktat-, Pyruvat- an Tryptophan-Niveauen am Serum-HC, BN an LA weisen, bestëmmt duerch LC-MS/MS (n = 70 pro Grupp). Wäiss a schwaarz gepunktete Linnen weisen de Median respektiv de Quartil un. e Violin-Diagramm, deen déi normaliséiert Log2TPM (Transkripte pro Millioun) mRNA-Expressioun vun SLC7A5 a QPRT am Lungenadenokarzinom (n = 513) am Verglach mat normalem Lungengewebe (n = 59) am LUAD-TCGA-Dataset weist. Déi wäiss Këscht representéiert den Interquartilberäich, déi horizontal schwaarz Linn an der Mëtt representéiert de Median, an déi vertikal schwaarz Linn, déi sech vun der Këscht aus erstreckt, representéiert den 95%-Konfidenzintervall (KI). f Pearson-Korrelatiounsdiagramm vun der SLC7A5- an GAPDH-Expressioun am Lungenadenokarzinom (n = 513) an normalem Lungengewebe (n = 59) am TCGA-Dataset. Déi gro Fläch representéiert den 95%-KI. r, Pearson-Korrelatiounskoeffizient. g Normaliséiert zellulär Tryptophanniveauen an A549-Zellen, déi mat netspezifescher shRNA-Kontroll (NC) an shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfizéiert goufen, bestëmmt duerch LC-MS/MS. Eng statistesch Analyse vu fënnef biologesch onofhängege Proben an all Grupp gëtt presentéiert. h Zellulär Niveauen vun NADt (total NAD, inklusiv NAD+ an NADH) an A549-Zellen (NC) an SLC7A5 Knockdown A549-Zellen (Sh1, Sh2). Eng statistesch Analyse vun dräi biologesch onofhängege Proben an all Grupp gëtt presentéiert. D'glykolytesch Aktivitéit vun den A549-Zellen virun an nom SLC7A5-Knockdown gouf mat der extrazellulärer Acidifikatiounsquote (ECAR) gemooss (n = 4 biologesch onofhängeg Proben pro Grupp). 2-DG,2-Desoxy-D-Glukos. En zweesäitege Student's t-Test gouf an (b-h) benotzt. An (g-i) representéieren d'Fehlerbalken de Mëttelwäert ± SD, all Experiment gouf dräimol onofhängeg duerchgefouert an d'Resultater ware ähnlech. D'Quelldaten ginn a Form vu Quelldatendateien zur Verfügung gestallt.
Ënner Berécksiichtegung vum bedeitenden Impakt vum verännerte Tryptophan-Metabolismus an der LA-Grupp, hu mir och d'Serum-Tryptophan-Niveauen an den HC-, BN- a LA-Gruppen mat Hëllef vu QQQ ënnersicht. Mir hunn festgestallt, datt den Serum-Tryptophan an LA am Verglach mat HC oder BN reduzéiert war (p < 0,001, Figur 5d), wat mat fréiere Befunde konsequent ass, datt d'Zirkulatiouns-Tryptophan-Niveaue bei Patienten mat Lungenkrebs méi niddreg sinn wéi bei gesonde Kontrollpersounen aus der Kontrollgrupp33,34,35. Eng aner Studie mat dem PET/CT-Tracer 11C-Methyl-L-Tryptophan huet festgestallt, datt d'Tryptophan-Signalretentiounszäit am Lungenkrebsgewebe am Verglach mat benignen Läsionen oder normalem Gewief36 signifikant erhéicht war. Mir stellen d'Hypothes op, datt d'Ofsenkung vum Tryptophan am LA-Serum eng aktiv Tryptophanopnahm duerch Lungenkrebszellen reflektéiere kéint.
Et ass och bekannt, datt den Endprodukt vum Kynurenin-Wee vum Tryptophan-Katabolismus NAD+37,38 ass, wat e wichtegt Substrat fir d'Reaktioun vu Glyceraldehyd-3-phosphat mat 1,3-Bisphosphoglycerat an der Glykolyse39 ass. Wärend fréier Studien sech op d'Roll vum Tryptophan-Katabolismus an der Immunreguléierung konzentréiert hunn, hu mir probéiert d'Zesummespill tëscht Tryptophan-Dysreguléierung a glykolytesche Weeër ze klären, déi an der aktueller Studie observéiert goufen. D'Léisungsmëtteltransporterfamill 7 Member 5 (SLC7A5) ass bekannt als en Tryptophan-Transporter43,44,45. Chinolinsäurephosphoribosyltransferase (QPRT) ass en Enzym, dat sech no ënnen vum Kynurenin-Wee befënnt a Chinolinsäure an NAMN46 ëmwandelt. D'Inspektioun vum LUAD TCGA Datesaz huet gewisen, datt souwuel SLC7A5 wéi och QPRT am Tumorgewebe am Verglach zum normale Gewief signifikant eropreguléiert waren (Fig. 5e). Dës Erhéijung gouf an de Stadien I an II souwéi an de Stadien III an IV vum Lungenadenokarzinom observéiert (Ergänzungsfigur 11), wat op fréi Stéierungen am Tryptophan-Metabolismus hiweist, déi mat der Tumorgenesis verbonne sinn.
Zousätzlech huet den LUAD-TCGA Datesaz eng positiv Korrelatioun tëscht der SLC7A5 an der GAPDH mRNA-Expressioun a Kriibspatientenproben gewisen (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figur 5f). Am Géigesaz dozou gouf keng signifikant Korrelatioun tëscht sou Gensignaturen am normale Longengewebe fonnt (r = 0,25, p = 0,06, Figur 5f). D'Ofsenkung vum SLC7A5 (Ergänzungsfigur 12) an A549 Zellen huet den zellulären Tryptophan- an NAD(H)-Niveau däitlech reduzéiert (Figur 5g,h), wat zu enger ofgeschwächter glykolytescher Aktivitéit gefouert huet, gemooss duerch d'extrazellulär Acidifikatiounsquote (ECAR) (Figur 1). 5i). Dofir stellen mir, baséierend op metabolesche Verännerungen am Serum an der In-vitro-Detektioun, d'Hypothes op, datt den Tryptophan-Metabolismus NAD+ iwwer de Kynurenin-Wee produzéiere kann an eng wichteg Roll bei der Fërderung vun der Glykolyse bei Longenkriibs spillt.
Studien hunn gewisen, datt eng grouss Zuel vun onbestëmmten Lungenknäppchen, déi duerch LDCT entdeckt goufen, zu der Noutwennegkeet vun zousätzlechen Tester wéi PET-CT, Lungenbiopsie an Iwwerbehandlung wéinst enger falsch-positiver Diagnos vun enger Malignitéit féiere kann.31 Wéi an der Figur 6 gewisen, huet eis Studie e Panel vu Serummetabolitte mat potenziellen diagnostesche Wäert identifizéiert, déi d'Risikostratifikatioun an déi spéider Behandlung vu Lungenknäppchen, déi duerch CT entdeckt goufen, verbessere kënnen.
Pulmonalknäppchen ginn mat Hëllef vun enger Nidderdosis-Computertomographie (LDCT) mat bildgebende Charakteristiken evaluéiert, déi op guttartigen oder bösartigen Ursaachen hiweisen. Den onséchere Verlaf vun den Knäppchen kann zu heefege Kontrollbesich, onnéidegen Interventiounen an Iwwerbehandlung féieren. D'Abezéiung vu Serummetabolismusklassifizéierer mat diagnosteschem Wäert kann d'Risikobewertung an déi spéider Behandlung vu Pulmonalknäppchen verbesseren. PET-Positronenemissiounstomographie.
Donnéeën aus der US-amerikanescher NLST-Studie an der europäescher NELSON-Studie suggeréieren, datt d'Screening vu Risikogruppen mat enger Niddregdosis-Computertomographie (LDCT) d'Mortalitéit duerch Lungenkrebs reduzéiere kann1,3. Wéi och ëmmer, d'Risikobewäertung an déi spéider klinesch Behandlung vun enger grousser Zuel vun zoufällegen Lungenknäppchen, déi duerch LDCT entdeckt goufen, bleiwen déi usprochsvollst. D'Haaptzil ass et, déi korrekt Klassifikatioun vun existente LDCT-baséierte Protokoller ze optimiséieren, andeems zouverlässeg Biomarker integréiert ginn.
Bestëmmt molekulare Biomarker, wéi Bluttmetabolitte, goufen identifizéiert andeems Lungenkrebs mat gesonde Kontrollpersounen verglach gouf15,17. An der aktueller Studie hu mir eis op d'Uwendung vun der Serummetabolomikanalyse konzentréiert fir tëscht benignen a bösartigen Lungenknäppchen z'ënnerscheeden, déi zoufälleg duerch LDCT entdeckt goufen. Mir hunn de globale Serummetabolom vu gesonde Kontrollpersounen (HC), benignen Lungenknäppchen (BN) a Lungenadenokarzinom (LA)-Prouwen am Stadium I mat Hëllef vun der UPLC-HRMS-Analyse verglach. Mir hunn festgestallt, datt HC a BN ähnlech metabolesch Profiler haten, während LA am Verglach mat HC a BN bedeitend Ännerungen gewisen huet. Mir hunn zwou Sätz vu Serummetabolitte identifizéiert, déi LA vun HC a BN ënnerscheeden.
Déi aktuell LDCT-baséiert Identifikatiounsmethod fir guttartigen a béisartigen Knëtschen baséiert haaptsächlech op der Gréisst, der Dicht, der Morphologie an der Wuestumsquote vun den Knëtschen am Laf vun der Zäit30. Fréier Studien hunn gewisen, datt d'Gréisst vun den Knëtschen enk mat der Wahrscheinlechkeet vu Lungenkrebs zesummenhänkt. Och bei Patienten mat héijem Risiko ass de Risiko vu Malignitéit an den Knëtschen <6 mm <1%. De Risiko vu Malignitéit fir Knëtschen mat enger Gréisst vu 6 bis 20 mm läit tëscht 8% an 64%30. Dofir recommandéiert d'Fleischner Gesellschaft en Duerchmiesser vu 6 mm fir d'routineméisseg CT-Nofolleg.29 Wéi och ëmmer, d'Risikobewäertung an d'Gestioun vun onbestëmmten Lungenknëtschen (IPN) méi grouss wéi 6 mm goufen net adäquat duerchgefouert31. Déi aktuell Behandlung vu kongenitalen Häerzkrankheeten baséiert normalerweis op engem waaksame Waarden mat reegelméisseger CT-Iwwerwaachung.
Baséierend op dem validéierte Metabolom hu mir fir d'éischt Kéier d'Iwwerlappung vu metabolomesche Signaturen tëscht gesonde Persounen a guttartigen Nodulen <6 mm demonstréiert. Déi biologesch Ähnlechkeet entsprécht fréiere CT-Befunde, datt de Risiko vu Malignitéit fir Nodulen <6 mm sou niddreg ass wéi fir Persounen ouni Nodulen.30 Et sollt bemierkt ginn, datt eis Resultater och weisen, datt guttartigen Nodulen <6 mm an ≥6 mm eng héich Ähnlechkeet a metabolomesche Profiler hunn, wat drop hiweist, datt d'funktionell Definitioun vu guttartigen Ätiologie onofhängeg vun der Nodulgréisst konsequent ass. Dofir kënnen modern diagnostesch Serummetabolitpanele een eenzegen Assay als Ausschlusstest ubidden, wann Nodulen ufanks op der CT festgestallt ginn, a potenziell d'seriell Iwwerwaachung reduzéieren. Gläichzäiteg huet dee selwechte Panel vu metabolesche Biomarker béisartigen Nodulen ≥6 mm grouss vu guttartigen Nodulen ënnerscheet a korrekt Prognosen fir IPNs vun ähnlecher Gréisst an zweideitege morphologeschen Eegeschafte op CT-Biller geliwwert. Dëse Serummetabolismus-Klassifizéierer huet gutt Resultater bei der Prognose vun der Malignitéit vun Nodulen ≥6 mm mat engem AUC vun 0,927 erreecht. Zesummegeholl weisen eis Resultater drop hin, datt eenzegaarteg Serum-Metabolomiksignaturen speziell fréi tumorinduzéiert metabolesch Verännerunge reflektéiere kënnen a potenziellen Wäert als Risikoprädiktoren hunn, onofhängeg vun der Gréisst vum Knuet.
Besonnesch ass et ze bemierken, datt Lungenadenokarzinom (LUAD) a Plattenepithelkarzinom (LUSC) déi Haaptarten vun net-klengzellegem Lungenkriibs (NSCLC) sinn. Well LUSC staark mam Tubakskonsum assoziéiert ass47 an LUAD déi heefegst Histologie vun zoufällegen Lungenknäppchen ass, déi beim CT-Screening festgestallt ginn48, gouf eist Klassifizéierungsmodell speziell fir Adenokarzinomprouwen am Stadium I entwéckelt. De Wang a seng Kollegen hunn sech och op LUAD konzentréiert an néng Lipidsignaturen identifizéiert mat Hëllef vu Lipidomik, fir Lungenkriibs am fréie Stadium vun gesonde Persounen z'ënnerscheeden17. Mir hunn dat aktuellt Klassifizéierungsmodell op 16 Fäll vu Stadium I LUSC an 74 guttartigen Knäppchen getest an eng niddreg LUSC-Prognosegenauegkeet (AUC 0,776) observéiert, wat drop hiweist, datt LUAD a LUSC hir eege metabolomesch Signaturen hunn. Tatsächlech gouf gewisen, datt LUAD a LUSC sech a punkto Etiologie, biologeschen Urspronk a geneteschen Aberratiounen ënnerscheeden49. Dofir sollten aner Aarte vun Histologie an Trainingsmodeller fir d'populatiounsbaséiert Detektioun vu Lungenkrebs a Screeningprogrammer abegraff ginn.
Hei hu mir déi sechs heefegst verännert Weeër beim Lungenadenokarzinom am Verglach mat gesonde Kontrollpersounen a benignen Nodulen identifizéiert. Xanthin an Hypoxanthin si gemeinsam Metabolitte vum Purin-Methabolismuswee. Am Aklang mat eise Resultater waren d'Tëscheprodukter, déi mam Purin-Methabolismus assoziéiert sinn, am Serum oder Gewëss vu Patienten mat Lungenadenokarzinom am Verglach mat gesonde Kontrollpersounen oder Patienten am präinvasive Stadium signifikant erhéicht15,50. Erhéicht Serum-Xanthin- an Hypoxanthin-Niveaue kënnen den Anabolismus reflektéieren, deen duerch séier proliferéierend Kriibszellen erfuerderlech ass. Eng Dysreguléierung vum Glukosmetabolismus ass e bekannt Kennzeechen vum Kriibsmetabolismus51. Hei hu mir eng bedeitend Erhéijung vu Pyruvat a Laktat an der LA-Grupp am Verglach mat der HC- a BN-Grupp observéiert, wat mat fréiere Berichter iwwer glykolytesch Wee-Anomalien an de Serummetabolomprofile vu Patienten mat net-klengzellegem Lungenkrebs (NSCLC) a gesonde Kontrollpersounen iwwereneestëmmt. D'Resultater si konsequent52,53.
Wichteg ass, datt mir eng invers Korrelatioun tëscht Pyruvat- a Tryptophan-Metabolismus am Serum vu Lungenadenokarzinomen observéiert hunn. D'Serumtryptophanniveauen waren an der LA-Grupp am Verglach mat der HC- oder BN-Grupp reduzéiert. Interessanterweis huet eng fréier grouss ugeluechte Studie mat enger prospektiver Kohort festgestallt, datt niddreg Niveauen u zirkulierendem Tryptophan mat engem erhéichte Risiko fir Lungenkrebs verbonne waren 54. Tryptophan ass eng essentiell Aminosaier, déi mir komplett aus der Nahrung kréien. Mir schléissen doraus, datt d'Serumtryptophan-Ofsenkung bei Lungenadenokarzinom eng séier Ofsenkung vun dësem Metabolit reflektéiere kann. Et ass bekannt, datt d'Endprodukt vum Tryptophan-Katabolismus iwwer de Kynurenin-Wee d'Quell vun der de novo NAD+ Synthese ass. Well NAD+ haaptsächlech iwwer de Salvage-Wee produzéiert gëtt, bleift d'Wichtegkeet vun NAD+ am Tryptophan-Metabolismus bei der Gesondheet a Krankheet ze bestëmmen 46. Eis Analyse vun der TCGA-Datebank huet gewisen, datt d'Expressioun vum Tryptophan-Transporter-Solute-Transporter 7A5 (SLC7A5) am Lungenadenokarzinom am Verglach mat normale Kontrollgruppen signifikant erhéicht war a positiv mat der Expressioun vum glykolyteschen Enzym GAPDH korreléiert war. Fréier Studien hunn sech haaptsächlech op d'Roll vum Tryptophan-Katabolismus bei der Ënnerdréckung vun der Antitumor-Immunantwort konzentréiert40,41,42. Hei weisen mir, datt d'Inhibitioun vun der Tryptophan-Opnahm duerch den Knockdown vun SLC7A5 a Lungenkrebszellen zu enger spéiderer Ofsenkung vun den zellulären NAD-Niveauen an enger gläichzäiteger Ofschwächung vun der glykolytescher Aktivitéit féiert. Zesummefaassend liwwert eis Studie eng biologesch Basis fir Verännerungen am Serummetabolismus, déi mat der bösarteger Transformatioun vum Lungenadenokarzinom assoziéiert sinn.
EGFR-Mutatioune sinn déi heefegst Treibermutatioune bei Patienten mat NSCLC. An eiser Studie hu mir festgestallt, datt Patienten mat EGFR-Mutatioun (n = 41) allgemeng metabolesch Profiler ähnlech wéi Patienten mat Wildtyp-EGFR (n = 31) haten, obwuel mir reduzéiert Serumniveauen bei e puer EGFR-Mutantpatienten bei Acylcarnitinpatienten festgestallt hunn. Déi etabléiert Funktioun vun Acylcarnitinen ass et, Acylgruppen aus dem Zytoplasma an d'Mitochondriamatrix ze transportéieren, wat zu der Oxidatioun vu Fettsaieren féiert fir Energie ze produzéieren 55. Am Aklang mat eise Resultater huet eng rezent Studie och ähnlech Metabolomprofiler tëscht EGFR-Mutanten an EGFR-Wildtyp-Tumoren identifizéiert andeems de globale Metabolom vun 102 Lungenadenokarzinom-Gewëbsproben analyséiert gouf 50. Interessanterweis gouf den Acylcarnitin-Gehalt och an der EGFR-Mutantgrupp fonnt. Dofir kéint et weider Studien erfuerderen, ob Ännerungen an den Acylcarnitinniveauen EGFR-induzéiert metabolesch Verännerungen an déi zugronnleeënd molekular Weeër reflektéieren.
Schlussendlech etabléiert eis Studie e Serummetabolismusklassifikator fir d'Differenzialdiagnos vu pulmonalen Knötchen a proposéiert e Workflow, deen d'Risikobewertung optimiséiere kann an d'klinescht Management baséiert op CT-Scan-Screening erliichtere kann.
Dës Studie gouf vum Ethikkomitee vum Sun Yat-sen University Cancer Hospital, dem First Affiliated Hospital vun der Sun Yat-sen University an dem Ethikkomitee vum Zhengzhou University Cancer Hospital guttgeheescht. An den Discovery- an internen Validatiounsgruppen goufen 174 Sera vu gesonde Persounen an 244 Sera vu benignen Nodulen vu Persounen gesammelt, déi alljährlech medezinesch Ënnersichungen am Department of Cancer Control and Prevention vum Sun Yat-sen University Cancer Center gemaach hunn, an 166 benign Nodulen Serum. Lungenadenokarzinomer am Stadium I goufen vum Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt. An der externer Validatiounskohort gouf et 48 Fäll vu benignen Nodulen, 39 Fäll vu Lungenadenokarzinom am Stadium I vum First Affiliated Hospital vun der Sun Yat-sen University an 24 Fäll vu Lungenadenokarzinom am Stadium I vum Zhengzhou Cancer Hospital. De Sun Yat-sen University Cancer Center huet och 16 Fäll vu Plattenepithel-Lungenkriibs am Stadium I gesammelt, fir d'diagnostesch Fäegkeet vum etabléierte metabolesche Klassifizéierer ze testen (Patientencharakteristike sinn an der Ergänzungstabell 5 gewisen). Prouwe vun der Discovery-Kohort an der interner Validatiounskohort goufen tëscht Januar 2018 a Mee 2020 gesammelt. Prouwe fir déi extern Validatiounskohort goufen tëscht August 2021 an Oktober 2022 gesammelt. Fir de Geschlechterbias ze minimiséieren, goufen ongeféier déiselwecht Zuel vu männlechen a weibleche Fäll all Kohort zougewisen. Discovery-Team an internt Iwwerpréiwungsteam. D'Geschlecht vun de Participanten gouf op Basis vun der Selbstberichterstattung festgestallt. Eng informéiert Zoustëmmung gouf vun alle Participanten kritt an et gouf keng Kompensatioun virgesinn. Persounen mat benignen Knëtschen waren déi mat engem stabile CT-Scan-Score no 2 bis 5 Joer zum Zäitpunkt vun der Analyse, ausser 1 Fall aus der externer Validatiounsprouf, déi präoperativ gesammelt an duerch Histopathologie diagnostizéiert gouf. Mat Ausnam vun chronescher Bronchitis. Lungenadenokarzinom-Fäll goufen virun der Lungenresektion gesammelt an duerch pathologesch Diagnos bestätegt. Nüchternbluttprouwe goufen a Serumtrennerréier ouni Antikoagulantien gesammelt. D'Bluttprouwe goufen 1 Stonn bei Raumtemperatur gerinnert an dann 10 Minutte bei 2851 × g bei 4°C zentrifugéiert fir Serumsupernatant ze sammelen. Serumaliquote goufen bei -80°C agefruer bis zur Metabolitextraktioun. Den Departement fir Kriibspräventioun a medizinesch Untersuchung vum Sun Yat-sen University Cancer Center huet e Pool vu Serum vun 100 gesonde Spender gesammelt, dorënner eng gläich Zuel vu Männer a Fraen am Alter vun 40 bis 55 Joer. Gläich Deeler vun all Spenderprobe goufen gemëscht, de resultéierende Pool gouf aliquotéiert a bei -80°C gelagert. D'Serummëschung gouf als Referenzmaterial fir d'Qualitéitskontroll an d'Datenstandardiséierung benotzt.
Referenzserum a Testproben goufen opgetaut an d'Metabolitte goufen mat enger kombinéierter Extraktiounsmethod (MTBE/Methanol/Waasser) extrahéiert 56. Kuerz gesot, goufen 50 μl Serum mat 225 μl äiskalem Methanol a 750 μl äiskalem Methyl-tert-butylether (MTBE) gemëscht. D'Mëschung gëtt 1 Stonn op Äis réiert an inkubéiert. D'Proben goufen dann gemëscht a mat 188 μl MS-Qualitéitswaasser mat internen Standarden (13C-Laktat, 13C3-Pyruvat, 13C-Methionin an 13C6-Isoleucin, kaaft vu Cambridge Isotope Laboratories) gevortext. D'Mëschung gouf dann 10 Minutte bei 4 °C bei 15.000 × g zentrifugéiert, an déi ënnescht Phas gouf an zwee Réier (jee 125 μL) fir d'LC-MS-Analyse a positiven an negativen Modus transferéiert. Schlussendlech gouf d'Prouf an engem High-Speed-Vakuumkonzentrator dréchen verdampft.
Déi gedréchent Metabolitte goufen an 120 μl 80% Acetonitril rekonstituéiert, 5 Minutte laang gevirbelt an 10 Minutte laang bei 4°C bei 15.000 × g zentrifugéiert. D'Iwwerstandsstoffer goufen an amberfaarweg Glasfläschchen mat Mikroasätz fir Metabolomik-Studien transferéiert. Ongezielte Metabolomik-Analyse op enger Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie-Héichopléisungs-Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) Plattform. Metabolitte goufen mat engem Dionex Ultimate 3000 UPLC System an enger ACQUITY BEH Amid-Sail (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) getrennt. Am Positiv-Ionen-Modus bestoungen déi mobil Phasen aus 95% (A) an 50% Acetonitril (B), déi all 10 mmol/L Ammoniumacetat an 0,1% Amberesäure enthalen hunn. Am negativen Modus hunn déi mobil Phasen A a B 95% respektiv 50% Acetonitril enthale, béid Phasen hunn 10 mmol/L Ammoniumacetat, pH = 9, enthale. De Gradientprogramm war wéi follegt: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. D'Kolonn gouf bei 40°C an d'Prouf bei 10°C am Autosampler gehalen. D'Duerchflussrate war 0,3 ml/min, den Injektiounsvolumen war 3 μl. E Q-Exactive Orbitrap Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mat enger Elektrospray-Ioniséierungsquell (ESI) gouf am Vollscanmodus bedriwwen a mam ddMS2-Iwwerwaachungsmodus gekoppelt fir grouss Datenmengen ze sammelen. D'MS-Parameter goufen wéi follegt agestallt: Sprëtzspannung +3,8 kV/- 3,2 kV, Kapillartemperatur 320 °C, Schutzgas 40 arb, Hëllefsgas 10 arb, Sondenheizungstemperatur 350 °C, Scanberäich 70–1050 m/h, Opléisung 70 000. D'Donnéeë goufe mat Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) gesammelt.
Fir d'Datenqualitéit ze evaluéieren, goufen zesummegefaasst Qualitéitskontroll- (QC-) Prouwen generéiert andeems 10 μL Aliquoten vum Iwwerstand aus all Prouf ewechgeholl goufen. Sechs Qualitéitskontroll-Prouweninjektiounen goufen um Ufank vun der analytescher Sequenz analyséiert fir d'Stabilitéit vum UPLC-MS-System ze evaluéieren. Qualitéitskontroll-Prouwen ginn dann periodesch an de Batch agefouert. All 11 Chargen vu Serumprouwen an dëser Studie goufen duerch LC-MS analyséiert. Aliquoten vun enger Serumpoolmëschung vun 100 gesonde Spender goufen als Referenzmaterial an de jeeweilege Chargen benotzt fir den Extraktiounsprozess ze iwwerwaachen an d'Batch-zu-Batch-Effekter unzepassen. Eng onzieleg Metabolomik-Analyse vun der Discovery-Kohort, der interner Validatiounskohort an der externer Validatiounskohort gouf am Metabolomics Center vun der Sun Yat-sen Universitéit duerchgefouert. Den externen Laboratoire vum Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center huet och 40 Prouwen aus der externer Kohort analyséiert fir d'Leeschtung vum Klassifizéierermodell ze testen.
No der Extraktioun an der Rekonstitutioun gouf d'absolut Quantifizéierung vun de Serummetabolitte mat Hëllef vun Ultra-High-Performance-Flëssegkeetschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (Agilent 6495 Triple Quadrupole) mat enger Elektrospray-Ioniséierungsquell (ESI) am Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus gemooss. Eng ACQUITY BEH Amid-Sail (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) gouf benotzt fir d'Metabolitte ze trennen. Déi mobil Phase bestoung aus 90% (A) an 5% Acetonitril (B) mat 10 mmol/L Ammoniumacetat an 0,1% Ammoniakléisung. De Gradientprogramm war wéi follegt: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. D'Kolonn gouf bei 40 °C an d'Prouf bei 10 °C am Autosampler gehalen. Den Duerchflussrate war 0,3 mL/min an den Injektiounsvolumen war 1 μL. MS-Parameter goufen wéi follegt festgeluecht: Kapillarspannung ±3,5 kV, Verneblerdrock 35 psi, Hüllegasduerchfluss 12 L/min, Hüllegastemperatur 350 °C, Dréchnungsgastemperatur 250 °C an Dréchnungsgasduerchfluss 14 l/min. D'MRM-Konversiounen vun Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin a Xanthin waren 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 an 151,0–107,9 respektiv. D'Donnéeë goufe mat Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) gesammelt. Fir Serumprouwen goufen Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin a Xanthin mat Hëllef vu Kalibratiounskurven vu Standardmëschungsléisungen quantifizéiert. Fir Zellprouwen gouf den Tryptophan-Gehalt un den internen Standard an d'Zellproteinmass normaliséiert.
D'Peak-Extraktioun (m/z an Retentiounszäit (RT)) gouf mat Compound Discovery 3.1 an TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) duerchgefouert. Fir potenziell Ënnerscheeder tëscht de Chargen ze eliminéieren, gouf all charakteristesche Peak vun der Testprouf duerch de charakteristesche Peak vum Referenzmaterial aus dem selwechte Charge gedeelt, fir déi relativ Heefegkeet ze kréien. Déi relativ Standardofwäichunge vun internen Standarden virun an no der Standardiséierung sinn an der Ergänzungstabell 6 gewisen. D'Ënnerscheeder tëscht den zwou Gruppe goufen duerch d'Falsch-Entdeckungsquote (FDR<0,05, Wilcoxon Signed Rank Test) an d'Falschännerung (>1,2 oder <0,83) charakteriséiert. Réi MS-Date vun den extrahéierten Eegeschaften an d'Referenzserum-korrigéiert MS-Date sinn an den Ergänzungsdaten 1 respektiv an den Ergänzungsdaten 2 gewisen. D'Peak-Annotatioun gouf op Basis vu véier definéierten Identifikatiounsniveauen duerchgefouert, dorënner identifizéiert Metabolitten, potenziell annotéiert Verbindungen, potenziell charakteriséiert Verbindungsklassen an onbekannt Verbindungen 22. Baséierend op Datebanksich a Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) goufen biologesch Verbindungen mat MS/MS-matchende validéierte Standarden oder exakten Annotatiounen a mzCloud (Score > 85) oder Chemspider schliisslech als Zwëschenprodukter tëscht dem differentiellen Metabolom ausgewielt. Peak-Annotatiounen fir all Feature sinn an den Ergänzungsdaten 3 abegraff. MetaboAnalyst 5.0 gouf fir d'univariat Analyse vun der sum-normaliséierter Metabolit-Heefegkeet benotzt. MetaboAnalyst 5.0 huet och d'KEGG-Weeër-Beräicherungsanalyse baséiert op signifikant ënnerschiddleche Metabolitten evaluéiert. D'Haaptkomponentenanalyse (PCA) an d'partial least squares diskriminant Analyse (PLS-DA) goufen mat dem ropls Softwarepaket (v.1.26.4) mat Stack Normaliséierung an Autoskaléierung analyséiert. Dat optimalt Metabolit-Biomarkermodell fir d'Prognose vun Nodul-Malignitéit gouf mat binärer logistescher Regressioun mat least absolute Shrinkage an dem Selektiounsoperator (LASSO, R Package v.4.1-3) generéiert. D'Performance vum Diskriminatiounsmodell an den Detektiouns- a Validatiounssätz gouf charakteriséiert andeems d'AUC op Basis vun der ROC-Analyse no dem pROC-Paket (v.1.18.0.) geschätzt gouf. De optimale Wahrscheinlechkeetsgrenzwäert gouf op Basis vum maximalen Youden-Index vum Modell (Sensibilitéit + Spezifizitéit – 1) kritt. Prouwe mat Wäerter méi kleng oder méi grouss wéi de Schwellwäert ginn als guttartigen Nodulen respektiv Lungenadenokarzinom virausgesot.
A549-Zellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) goufen an engem F-12K-Medium mat 10% FBS ugebaut. Kuerz Hairpin-RNA (shRNA)-Sequenzen, déi op SLC7A5 gezielt sinn, an eng net-zielgezielt Kontroll (NC) goufen an de lentivirale Vektor pLKO.1-puro agefouert. D'Antisense-Sequenze vun shSLC7A5 sinn wéi follegt: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikörper géint SLC7A5 (#5347) an Tubulin (#2148) goufen vun Cell Signaling Technology kaaft. Antikörper géint SLC7A5 an Tubulin goufen an enger Verdënnung vun 1:1000 fir d'Western-Blot-Analyse benotzt.
De Seahorse XF Glykolytesche Stresstest moosst d'extrazellulär Acidifikatiounsniveauen (ECAR). Am Test goufen Glukos, Oligomycin A an 2-DG sequentiell verabreicht fir d'zellulär glykolytesch Kapazitéit ze testen, gemooss duerch ECAR.
A549-Zellen, déi mat net-zielgerechter Kontroll (NC) an shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfizéiert goufen, goufen iwwer Nuecht a Schosselen mat engem Duerchmiesser vun 10 cm ausgeplatt. Zellmetabolitte goufen mat 1 ml äiskalem 80% wässerege Methanol extrahéiert. D'Zellen an der Methanolléisung goufen ofgeschaaft, an en neit Réier gesammelt an 15 Minutte bei 4°C bei 15.000 × g zentrifugéiert. 800 µl Iwwerstand sammelen an mat engem High-Speed-Vakuumkonzentrator dréchnen. Déi gedréchent Metabolitpellets goufen dann op Tryptophanniveauen mat LC-MS/MS analyséiert, wéi uewe beschriwwen. D'zellulär NAD(H)-Niveauen an den A549-Zellen (NC an shSLC7A5) goufen mat engem quantitativen NAD+/NADH-kolorimetresche Kit (#K337, BioVision) no den Instruktioune vum Hiersteller gemooss. D'Proteinniveauen goufen fir all Prouf gemooss, fir d'Quantitéit vun de Metabolitten ze normaliséieren.
Et goufen keng statistesch Methoden benotzt fir d'Proufgréisst virleefeg ze bestëmmen. Fréier Metabolomikstudien, déi op d'Entdeckung vu Biomarker abzielten15,18, goufen als Benchmarks fir d'Gréisstbestëmmung ugesinn, an am Verglach mat dëse Rapporten war eis Prouf adäquat. Keng Prouwe goufen aus der Studiekohort ausgeschloss. Serumprouwe goufen zoufälleg an eng Entdeckungsgrupp (306 Fäll, 74,6%) an eng intern Validatiounsgrupp (104 Fäll, 25,4%) fir net-gezielte Metabolomikstudien zougewisen. Mir hunn och zoufälleg 70 Fäll aus all Grupp aus dem Entdeckungsset fir gezielte Metabolomikstudien ausgewielt. D'Fuerscher ware blann fir d'Gruppenzouweisung während der LC-MS Datensammlung an -analyse. Statistesch Analysen vun Metabolomikdaten an Zellexperimenter ginn an de jeeweilege Resultater-, Figurelegenden- a Methodesektiounen beschriwwen. D'Quantifizéierung vum zelluläre Tryptophan, NADT an der glykolytescher Aktivitéit gouf dräimol onofhängeg mat identesche Resultater duerchgefouert.
Fir méi Informatiounen iwwer den Design vun der Studie, kuckt den Natural Portfolio Report Abstract, deen zu dësem Artikel gehéiert.
Déi réi MS-Donnéeë vun den extrahéierten Eegeschaften an déi normaliséiert MS-Donnéeë vum Referenzserum ginn an den Ergänzungsdaten 1 respektiv den Ergänzungsdaten 2 gewisen. Peak-Annotatioune fir Differenziell Eegeschafte ginn an den Ergänzungsdaten 3 presentéiert. Den LUAD TCGA-Dataset kann vun https://portal.gdc.cancer.gov/ erofgeluede ginn. D'Input-Donnéeë fir d'Zeechnen vum Grafik sinn an den Quelldaten uginn. D'Quelldaten ginn fir dësen Artikel uginn.
National Lung Screening Study Group, etc. Reduktioun vun der Mortalitéit duerch Lungenkrebs mat Low-Dose Computertomographie. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Lungenkrebsscreening mat Hëllef vun enger gerénger Dosis-Spiral-CT: Resultater vun der National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Reduktioun vun der Mortalitéit duerch Lungenkrebs mat volumetreschem CT-Screening an enger randomiséierter Studie. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 18. September 2023